本发明涉及肿瘤dna疫苗领域，具体地说，本发明涉及靶向fapα的重组dna载体cpvr-shf(m)及其密码子优化后的重组dna载体cpvr-oshf(m)在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
背景技术：
技术实现要素：
下面对本发明的技术方案介绍如下：
本发明所述的一种seqidno:1所示的shf(m)dna片段，所述序列包含一段kozak序列，一段分泌信号肽tpa序列，及fapα胞外段核苷酸序列(氨基酸序列为27位到760位)。
本发明所述的一种seqidno:2所示的shf(m)dna片段，具有与shf(m)相同的氨基酸序列，在序列seqidno:1基础上进行了密码子优化，提高了蛋白表达水平；seqidno:2与seqidno:1的核苷酸序列同源性下降到76％，更有助于在体内对基因分布进行监测。
本发明还包括上述dna片段序列制备的dna疫苗及其在抗肿瘤免疫治疗中的应用。
为了提高疫苗应用的安全性和有效性，本发明对全长fapα进行了优化，新形式的fapα只包含原始fapα的胞外部分，这样可以完全去除fapα促进肿瘤生长的作用以提高疫苗的安全性；同时有研究表明tpa信号肽能够促进目的蛋白的分泌表达更好的激活机体免疫系统，因此我们在新形式的fapα前端增加了tpa信号肽来提高疫苗的有效性。最后我们对新形式fapα的序列进行了密码子优化，以提高目的基因在人和小鼠体内的表达，并且降低了与原始序列的同源性，这样更便于在体内对疫苗分布的监测。
本发明的优点在于截取fapα的胞外段，并添加tpa信号肽，获得的新序列不仅具有更高的安全性，还具有分泌表达的能力，并且为了更好的提高序列的蛋白表达水平，以及方便对目的序列在体内分布的监测，对已优化的片段进行了密码子优化，这两种优化形式的fapα片段未见报道，并且以上述片段为基础构建的dna疫苗具有更强的抗肿瘤活性，这为基于肿瘤微基质抗原fapα的dna疫苗、病毒载体疫苗、rna疫苗、树突状细胞疫苗的构建和应用奠定了基础。
附图说明
图1a：dna疫苗载体cpvr；
图1b：dna疫苗cpvr-shf(m)，该重组质粒为将dna片段seqidno:1插入cpvr载体中形成；
图1c：dna疫苗cpvr-oshf(m)，该重组质粒为将dna片段seqidno:2插入cpvr载体中形成；
图1d：cpvr-shf(m)真核表达鉴定，cpvr载体(vec，阴性对照)、cpvr-hf(m)(cpvr-fap，阳性对照)、cpvr-shf(m)转染293t细胞后通过蛋白印记法证明目的蛋白表达；
图1e：cpvr-oshf(m)真核表达鉴定，cpvr载体(vec，阴性对照)、cpvr-shf(m)(阳性对照)、cpvr-oshf(m)转染293t细胞后通过蛋白印记法证明目的蛋白表达；
图2a：免疫原性实验免疫策略和分组，小鼠按图分为3组，每组5只，共免疫三次每次间隔两周，最后一次免疫两周后进行检测；
图2b：检测小鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，健康小鼠在完成免疫两周后，elispot法检测脾细胞释放ifn-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应fap小肽；
图2c：检测小鼠ctl杀伤靶细胞能力，健康小鼠在完成免疫两周后，分离小鼠淋巴细胞作为效应细胞，与用特异fap小肽标记的p815细胞作为靶细胞共孵育，cfse荧光标记法检测免疫小鼠的ctl应答能力(e：t＝25：1、50：1、100：1)；
图3a：cpvr-shf(m)与cpvr-hf(m)在模拟术后辅助治疗模型上的治疗策略和分组，小鼠按图分为3组，每组8只，在皮下接种4t1乳腺癌细胞两天后进行治疗，共免疫3针，间隔一周，在第30天进行检测；
图3b：elispot法检测小鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，荷瘤小鼠在第30天处死，用elispot法检测不同组小鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应fap小肽；
图3c：小鼠的肿瘤重量对比，在第30天处死小鼠后剥离皮下肿瘤并称重记录，与vec相比，cpvr-hf(m)组的肿瘤抑制率为38.4％，cpvr-shf(m)组的肿瘤抑制率为64.7％；
图3d：cpvr-shf(m)与cpvr-hf(m)在荷瘤模型上的的治疗策略和分组，小鼠按图分为3组，每组8只，在皮下接种4t1乳腺癌细胞七天后进行治疗(此时皮下已形成肿瘤)，共免疫3针，间隔一周，在第28天进行检测；
图3e：小鼠的肿瘤重量对比。在第28天处死小鼠后剥离皮下肿瘤并称重记录，与vec相比，cpvr-hf(m)组失去了对肿瘤抑制的能力，cpvr-shf(m)组的肿瘤抑制率为21.0％；
图4a：肿瘤内浸润的cd8+淋巴细胞检测，流式检测肿瘤中cd3+cd8+淋巴细胞在cd45+细胞中的比例，与cpvr-hf(m)相比，cpvr-shf(m)能促进更多的cd3+cd8+淋巴细胞浸润，p<0.05；
图4b：肿瘤组织中fapα的表达量，提取肿瘤组织rna并逆转录为cdna，再通过荧光定量pcr检测fapα在肿瘤中的表量，与cpvr-hf(m)相比，cpvr-shf(m)能够更好的清除fapα，p<0.01；
图4c：肿瘤组织中sdf-1的表达量，提取肿瘤组织rna并逆转录为cdna，再通过荧光定量pcr检测sdf-1在肿瘤中的表量，与cpvr-hf(m)相比，cpvr-shf(m)能够更好的减少sdf-1，p<0.001；
图5a：cpvr-oshf(m)与cpvr-shf(m)在荷瘤模型上的的治疗策略和分组，小鼠按图分为3组，每组8只，在皮下接种4t1乳腺癌细胞七天后进行治疗(此时皮下已形成肿瘤)，共免疫3针，间隔一周，在第28天进行检测；
图5b：不同组荷瘤鼠脾细胞释放ifn-γ的能力，小鼠完成疫苗治疗后，在第28天用elispot法检测脾细胞释放ifn-γ的能力，阴性刺激物为非特性小肽，阳性刺激物为对应fap小肽；
图5c：不同组荷瘤鼠的ctl杀伤靶细胞能力，取小鼠的脾脏中分离出的淋巴细胞为效应细胞，与靶细胞共孵育，采用cfse荧光标记法检测免疫小鼠的ctl应答(e：t＝50：1)；
图5d：小鼠的平均肿瘤体积生长，在小鼠皮下接种肿瘤细胞的第11天开始，每隔两天测量一次小鼠肿瘤体积并记录作图，平均值+sd，p<0.0001
图5e：肿瘤组织中fapα的表达量，提取肿瘤组织rna并逆转录为cdna，再通过荧光定量pcr检测fapα在肿瘤中的表量，与cpvr-shf(m)相比，cpvr-oshf(m)能够更好的清除fapα，p<0.05；
图5f：肿瘤组织中sdf-1的表达量，提取肿瘤组织rna并逆转录为cdna，再通过荧光定量pcr检测sdf-1在肿瘤中的表量，与cpvr-shf(m)相比，cpvr-oshf(m)能够更好的减少sdf-1，p<0.01。
具体实施方式
1.cpvr-shf(m)和cpvr-oshf(m)dna疫苗的构建及鉴定
所用载体为引入cpg基序的真核表达质粒vr1012，简称为cpvr，包含有启动子cmv，内含子a、bgh序列，cpg序列，卡纳霉素抗性序列，共5305bp，图谱见图1a。
以cpvr-hf(m)(及cpvr-fap)为模板，通过多步pcr获得核苷酸序列seqidno:1，并在两端引入bglii酶切位点和与载体两端序列相同的同源臂序列，将目的dna片段和经过bglii酶切获得的载体片段进行dna电泳和胶回收，获得目的片段和载体，使用同源重组试剂盒，50℃孵育15分钟，转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性的lb平板，37℃下培养过夜。挑选阳性菌落于5mllb培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒，用bglii酶切鉴定，并进行序列测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒cpvr-shf(m)，图谱见图1b。
分别将cpvr-hf(m)和cpvr-shf(m)以及cpvr空质粒转染293t细胞，48小时后收集细胞并裂解，获得蛋白样品进行westernblot蛋白免疫印迹分析，结果如图1d所示：cpvr-shf(m)质粒与cpvr-hf(m)阳性对照质粒转染的293细胞所表达的蛋白能够fapα特异性抗体染色，并且其分子量大小与预期分子量80kd相符合，cpvr阴性载体质粒没有检测到蛋白条带，结果说明cpvr-shf(m)能够正确表达目的基因编码的蛋白。
核苷酸序列seqidno:1经过密码子优化并通过基因合成目的核苷酸序列seqidno:2，并引入酶切位点psti和bamhi，将包含目的基因的质粒及载体经psti和bamhi双酶切后用胶回收试剂盒回收目的片段和载体，以t4dna连接酶，在16℃下连接过夜。转化大肠杆菌，涂布卡那霉素抗性的lb平板，并于37℃下培养过夜。挑选阳性菌落于5mllb培养基中37℃下培养16h，12000rpm离心收获菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒，用psti和bamhi进行双酶切鉴定，并进行序列测序鉴定，结果正确，即得到了重组质粒cpvr-oshf(m)，图谱见图1c。
分别将cpvr-shf(m)和cpvr-oshf(m)以及cpvr空质粒转染293t细胞，48小时后收集细胞并裂解，获得蛋白样品进行westernblot蛋白免疫印迹分析，结果如图1e所示：cpvr-oshf(m)质粒与cpvr-shf(m)阳性对照质粒转染的293t细胞所表达的蛋白能够被fapα特异性抗体染色，并且其分子量大小与预期分子量80kd相符合，cpvr阴性载体质粒没有检测到蛋白条带，并且可以看到cpvr-oshf(m)质粒的蛋白表达更强，结果说明cpvr-shf(m)能够正确表达目的基因编码的蛋白，且表达能力更强。
2.cpvr-shf(m)dna疫苗的免疫原性检测
为了比较新形式的疫苗与原始疫苗在诱导免疫反应上的差别，进行健康小鼠免疫原性实验。
3.cpvr-shf(m)dna疫苗的抗肿瘤应用
3.1.cpvr-shf(m)dna疫苗在模拟术后治疗肿瘤模型上的抗肿瘤应用
首先验证疫苗在辅助治疗肿瘤上的应用，在小鼠皮下接种肿瘤细胞两天后开始对小鼠进行疫苗治疗。
按照图3a，对小鼠进行分组(体重为16～18g的balb/c雌雄小鼠)，每组8只。包括包括vector空载体对照组，cpvr-hf(m)疫苗组，cpvr-shf(m)疫苗组。各组小鼠皮下接种2万个4t1肿瘤细胞，两天后开始免疫对应疫苗，共免疫3次，每次间隔1周。在最后一次免疫2周后，对小鼠进行安乐死，剥离小鼠脾脏进行免疫反应检测，同时剥离皮下肿瘤进行称重和分析。分离各组小鼠的脾脏，制备单细胞悬液，检测脾细胞fapα表位肽特异性ifn-γ分泌水平，如图3b所示，当用非特异性小肽(nspep)刺激后，cpvr-hf(m)组和cpvr-shf(m)组ifn-γ的斑点数相比于vec组明显提高(p<0.01)，其中cpvr-shf(m)相比较cpvr-hf(m)更加明显(p<0.05)，这说明cpvr-shf(m)和cpvr-hf(m)都能诱导fapα特异性免疫反应，且形式的cpvr-shf(m)诱导能力更强。
处死小鼠后剥离肿瘤，瘤重结果(图3c)显示：对比vector载体组，两者都能抑制肿瘤生长(p<0.01),且相比于cpvr-hf(m)，cpvr-shf(m)能更好的抑制4t1荷瘤鼠肿瘤生长的作用(p<0.05)；根据各组小鼠瘤重的平均重量计算抑瘤率，cpvr-shf(m)疫苗的抑瘤率为38.4％，cpvr-shf(m)疫苗的抑瘤率更是高达64.7％。说明cpvr-shf(m)疫苗的抑瘤效果优于cpvr-hf(m)疫苗。，
综上，cpvr-shf(m)和cpvr-hf(m)疫苗均可以有效诱导fapα特异性的细胞免疫反应，进而抑制肿瘤生长，并且新形式的cpvr-shf(m)诱导的特异性反应更强，抗肿瘤活性更高。
3.2.cpvr-shf(m)dna疫苗在肿瘤形成后模型上的抗肿瘤应用
选取体重为16～18g的balb/c小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4t1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤。按照图3d，随机将小鼠分为3组，每组8只，包括包括vector空载体对照组，cpvr-hf(m)疫苗组，cpvr-shf(m)疫苗组。在第7天开始采用腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫，共3次，每次间隔7天。在接种瘤后的第28天进行剥瘤称重。瘤重结果(图3e)显示：对比vector载体组，cpvr-hf(m)疫苗已经失去了抑制肿瘤的作用，而cpvr-shf(m)疫苗仍然具有很强的抗肿瘤效果(p<0.01)；根据平均瘤重计算抑瘤率，cpvr-shf(m)疫苗抑瘤率为21％，而cpvr-hf(m)疫苗的抑瘤率为0。
以上结果说明，在肿瘤形成后再展开治疗，新形式cpvr-shf(m)仍然具有较强的抗肿瘤效果。
综合3.1，3.2结果，表明新形式cpvr-shf(m)相比全长fapα疫苗cpvr-hf(m)在荷瘤小鼠上能够更好地诱导fapα特异性地免疫反应，同时具有更好的抗肿瘤效果。进而说明这种只含有胞外段fapα，并且带有分泌信号肽的shf(m)dna片段在制备抗肿瘤产品中更具有优势。
4.cpvr-shf(m)疫苗优于cpvr-hf(m)疫苗的机理探究。
为了探究cpvr-shf(m)在抗肿瘤活性上好于cpvr-hf(m)的原因，将剥离的肿瘤细胞进行胶原酶处理，分离成单细胞悬液，进行抗体染色流式细胞仪分析；同时提取肿瘤组织rna，逆转录成cdna，进行荧光定量pcr检测目的基因的相对表达量。
肿瘤单细胞悬液用pbs缓冲液洗两次后，用混有cd3、cd8和cd45的抗体的染色液进行染色，然后再洗涤两次后用染色液重悬进行流式细胞仪检测，分析cd3+cd8+t细胞在cd45+细胞中的比例，结果如图4a所示，相比cpvr-hf(m)疫苗，cpvr-shf(m)疫苗能够诱导更多的cd3+cd8+t细胞浸润到肿瘤内部，而cd3+cd8+t细胞是疫苗杀伤肿瘤的主要方式(p<0.05)。荧光定量pcr结果显示，cpvr-shf(m)疫苗相比于cpvr-hf(m)疫苗更好地清除了肿瘤中的fapα(图4b，p<0.01)和sdf-1(图4c，p<0.001)。
同时shf(m)dna片段只含有fapα的胞外段，因此可以完全封闭fapα的活性，具有更高的安全性，同时因为加入tpa分泌信号肽，可以更好地分泌表达蛋白，并诱导机体的免疫应答。
因此cpvr-shf(m)疫苗相比原始疫苗能够诱导更多的效应细胞进入肿瘤微环境中，靶向fapα，调节肿瘤微环境。
5.cpvr-oshf(m)疫苗与cpvr-hf(m)疫苗抗肿瘤效果比较。
5.1cpvr-oshf(m)疫苗与cpvr-hf(m)疫苗的抑制肿瘤生长活性
选取体重为16～18g的balb/c雌雄小鼠，在第0天以致死剂量(2万个)的4t1肿瘤细胞对小鼠进行右后背部皮下攻瘤，在第7天皮下肿瘤成瘤。按照图5a，随机将小鼠分为3组，每组8只，包括vector空载体对照组，cpvr-oshf(m)疫苗组，cpvr-shf(m)疫苗组。在第7天开始采用腿部肌肉注射的方式，对各组小鼠进行免疫，共3次，每次间隔7天。跟踪进行肿瘤体积的测定，肿瘤生长曲线(图5b)显示：对比vector组，cpvr-oshf(m)疫苗与cpvr-hf(m)疫苗都表现了明显的抑制4t1荷瘤鼠肿瘤生长的作用(p<0.0001)，但是二者没有明显地差异。同时脾细胞分泌ifn-γ水平(图5c)和脾细胞的特异性杀伤活性(图5d)，二者相较于vector都有明显地提高(p<0.01)，但同样二者没有明显区别。
以上结果表明，cpvr-oshf(m)疫苗与cpvr-hf(m)疫苗在诱导细胞免疫和抑制肿瘤地生长上作用相似，没有明显差异。
5.2cpvr-oshf(m)疫苗与cpvr-shf(m)疫苗在调节微环境上的差别
综合5.1与5.2，说明cpvr-oshf(m)疫苗与cpvr-shf(m)疫苗在激起免疫反应和抑制肿瘤生长作用上没有明细差异，但是cpvr-oshf(m)疫苗能够更好地调节肿瘤微环境。当cpvr-oshf(m)疫苗联合其他肿瘤疫苗和治疗手段(化疗，放疗，手术，免疫调节剂等)，也许会有更好地抗肿瘤效果。同时，由于oshf(m)dna片段在经过密码子优化后与原始fapα的序列同源性降到了76％，因此便于对体内目的片段分布监测，更适合临床实验研究。