1、软件的主要功能分四种，即引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA基元(motif)查找和同源性分析功能。前三种为其主要功能。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列"朗读"、DNA与蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。
一、限制性酶切点分析及基元查找功能
1、其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元(如-10序列，-35序列等)，按确定即可
2、常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到,你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元
二、引物设计
1、打开DNA序列后点击按钮primer，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整
2、搜索目的(SeachFor)有三种选项，PCR引物(PCRPrimers)、测序引物(SequencingPrimers)和杂交探针(HybridizationProbes)
3、搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sensePrimer，或Both)，或者成对查找(Pairs)，或者分别以适合上、下游引物为主(CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer)。另外还可改变选择区域(SearchRanges)，引物长度(PrimerLength)，选择方式(SearchMode)，参数选择(SearchParameters)等等
4、使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按search，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按OK，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序(Rating)排列，满分为100，即各指标基本都能达标
三、引物点击
1、点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier”主窗口，所得结果分三部分，
2、模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构(Hairpin)，二聚体(Dimer)，错误引发情况(FalsePriming)，及上下游引物之间二聚体形成情况(CrossDimer)
3、当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况
4、一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度
四、引物修饰编辑
1、在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列
3、对简并引物的分析不需像一般引物那样严格
4、总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件
获得基因序列后，打开primer5.0
点击File-new-DNAsequence
粘贴cDNA序列-asis-ok
点primer
点search-调整如图参数（产物长度一般为100-300，引物长度一般为20左右，视情况调整）
点ok，弹出的新窗口也点Ok
弹出下图窗口后，先看右边，根据系统设计的引物进行筛选，优先评分较高的
注：S是上游引物，A是下游引物，sense，anti-sense最好都是None，再细看
①ΔG绝对值小于10
②tm在58左右，正负2度
③GC%在40%-60%
④末端不能是A
⑤不能有连续3个相同的碱基
⑥3’端一定不能有错配
【筛选原则】：
1、最好hairpin,dimer,falsepriming没有
2、最好是没有连续相同碱基，如TTT、GGG
3、最好两个引物之间bp之差小于等于2，
4、产物长度大于100，小于300最好，也可以到400
5、tm在58左右，正负2度
6、一般设计时引物18-22长度，最长不要超过25
7、3’不能以A结尾
8、出现Found时，ΔG绝对值小于10
注：由于基因序列本身的差异，一般很难调到所有原则都满足，但是可以对系统给出的引物中的前几对进行调整，尽可能满足以上原则。
【如何调整】：
以系统给出的第一对引物为例（看框住的地方），虽然系统给出的评分比较高，但是下游引物可能出现发夹结构（Hairpin）和二聚体（Dimer），我们可以尝试调整一下。
首先点击左上角的A（Anti-sense），当图示的引物与A的颜色一直时，表示展示的是Anti-sense，然后把鼠标的光标放在引物的位置左右滑动，调整上下游引物位置。
下图是从3’往右移动了一个碱基，注意引物的长度会增加（只要是滑动了引物，改变了它的位置，长度就会增加，此时需要删除多余的碱基，到合适的长度）
点击EditPrimers，即可删除多余的碱基
弹出如下窗口后，光标点在①号位置，删除几个碱基后，
点击②号位置Analyze,点击③号位置ok
应该删除几个碱基？滑动之后多了5个碱基，一般是删除5个，但是下图我删除了6个，因为删除5个后末尾是A，我们在调整的时候可以多删，也可以少删，引物长度在合适范围即可
注意编辑引物时，只能从右边添加或删除碱基，如果想在左边添加或删除需要通过左右移动碱基的位置。有时候评分不错的上下游引物也可以调整，以下图为例，我想删掉5’端的一个C，降低GC含量
首先把光标放在引物的位置，将引物向后移动一个，看下图可以观察到引物向后移动了一个碱基，长度增加了，此时点击EditPrimers。
删除6个碱基后点击Analyze（分析）（删除几个碱基视情况而定）
最后的结果
5'CACTGACTGCCAGAAGACC3'
5'TACTCGTTCCAGGACCACC3'
【如何导出？先打开一个Excel文件】
点击Edit-copy-senseprimer-粘贴
点击Edit-copy-Antisenseprimer-粘贴
总结：根据系统给出的评分，看前几对引物是否是理想的引物，大部分情况不会都满足上述原则，需对前几对进行调整。（三步结合使用）
一：删除或添加末端碱基
二：拖动碱基的位置，向前移动一个或多个碱基或向后移动一个或多个碱基
三：点击EditPrimers，删除几个碱基后分析
终极大法：有时候调整了也达不到理想的效果，尝试耐着性子调整第一对，实在调不了，直接用第一对。