一文掌握MIQE指南的RT

考虑到mRNA转录的高度动态特性以及样品处理和下游处理步骤中引入的潜在变量，RT-qPCR工作流程的每个步骤的标准化方法对于可靠和可重现的结果至关重要。MIQE为这种方法提供了一份包含85个参数的清单，以确保质量结果符合任何期刊的接受标准。接下来，小编将为大家详细介绍如何应用MIQE指南来建立一个可靠的RT-qPCR实验流程。

▲图1：RT-qPCR基本流程

1、实验设计

正确的实验设计是任何基因表达研究的关键。由于mRNA转录对与研究过程无关的外部刺激敏感，因此严格控制和设计实验条件的工作是十分重要的。其中包括了确定实验程序、对照组、重复组的类型和数量、实验条件以及各组内的样品处理方法等，这些对于最小化变异性至关重要（表1）。

▲表1：RT-qPCR实验设计和样品管理

2、RNA提取及质控

样品需-80℃冷冻或使用RNA储存溶液进行储存。RNA提取程序应包括DNA酶处理步骤，以去除任何的基因组DNA污染。

▲表2：核酸质量控制方法概述

3、逆转录

4、引物和扩增子设计

引物设计和靶序列的选择是保证扩增产物特异性和高效性的关键。目前有许多软件或在线网站可设计引物对和确定扩增子，比如DNAMAN、PrimerPremier、Oligo、BeaconDesigner、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3Plus等等。

5、qPCR验证

qPCR验证是使用一组标准样品对引物退火温度、反应效率和特异性的适度范围进行评估的方法。具体步骤如下：1.根据仪器类型，选择合适的耗材和qPCR试剂；2.配置不同的PCR反应体系，凝胶电泳检测引物适宜浓度以及特异性；

▲图2：引物适宜浓度以及特异性测定

3.设置温度梯度测试引物适宜退火温度；

▲图3：引物适宜退火温度的测定

4.实验设置NTC、NRC、POS和NEG等对照组，来监控实验体系或污染；5.标准曲线的建立(评价PCR效率)。

▲图4：标准曲线，图源:AzureCieloqPCR系统

6、内参基因的选择

在RT-qPCR实验中，内参基因可以用于校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。一个好的内参基因应在不同时空样本或不同处理样本中具有相对稳定的表达水平，常见的有ATCB、GAPDH、β-actin、18SrRNA等。

7、实验重复性

▲图5：实验重复的设计

看完整个RT-qPCR实验流程，您是不是拨开RT-qPCR神秘的面纱了呢，现在快快来申请AzureCielo实时荧光定量PCR系统，来感受AzureCielo带给您的真实可靠的RT-qPCR数据。

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