定点诱变实验——利用PCR引物点突变

对于任何一种遗传学研究，尤其是有关基因的结构与功能的分析，突变都是最基本的手段。经典的方法是，应用能够修饰DNA分子的化学诱变剂或物理诱变剂处理生物体。此类诱变方法虽然已得到了广泛的应用，获得了大量的突变体，但亦存在着诸多的不便之处。第一、经受诱变剂处理的生物体，它的任何基因都有可能发生突变

实验方法原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。单点突变的原理是从常规E.coli中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提得到质粒。设计一对包含突变位点的

本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信

实验方法原理此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基

自发突变。在自然界中发生的，由于自然界中诱变剂的作用结果或偶然的DNA复制错误并被保留下来。此类引起突变的频率很低。诱导突变。由于物理、化学原因，导致DNA发生了改变。例如射线（紫外线，伦琴射线等）。

转换：嘌呤和嘌呤之间的替换，或嘧啶和嘧啶之间的替换。颠换：嘌呤和嘧啶之间的替换，即嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化。

本文先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一我们吊出来的基因有点突变

什么是PCR？聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。PCR技术发展简史PCR之父KaryMullisPCR反应基本原理和反应过程基本原理：反应过程：变性——将被复制的DNA片段在高于其Tm的条件下（94~9

如何鉴定CRISPR/Cas9点突变小鼠转基因鼠以及ES打靶技术构建鼠？基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。上期我们讲述了CRI

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primerle

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primerl

随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。OligodT

对靶序列中潜在的引物位点进行分析，这些位点应该不会形成同源多聚体结构，也没有明显的形成二级结构的趋势，不会自身互补，与基因组中的其他序列无显著的同源性。（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度。（2）选择一对匹配完好的正向和反向引

①引物长度一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-

随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。OligodT适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由

引物（primers)：引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。引物的重要性：在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏

①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右。②引物扩增跨度:以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内

储备液一般是100uM，也有稀释成10uM的。反正做PCR的最终其工作液终浓度范围是0.2μmol/L左右。我一般把引物稀释成10uM，25微升PCR体系一般加0.4-1.0微升的引物。

基因突变(genemutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutantgene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技

基因突变(genemutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶性肿瘤发生有关的突变基因(mutantgene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术