1、CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnologyArobustCRISPR/Cas9vectorsystemformultiplextargetingofgenomicsitesinmonocotanddicotplants亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室华南农业大学生命科学学院刘耀光课题组(.cn)1.pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术(图1)。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guideRNA(sgRN
2、A)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶(ZFNs),TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点BsaI位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR方法拼装好，再利用GoldenGate或GibsonAssembly克隆方法组装到双元载体上。RuvC-likedomainCas
8、65;LCRlSPftCas9P3S1S-N(15011bp)pYLCRISPFVCafiP-S(14743bp)iisLPKanRasdABarpVS1FEplioan吕L日皆吉ItjTCGTOCTCCACATGT5fufgalSsalB-RGARAscIA/ofI鈕*5)GACpCGTGGGTCTCGCGGTATCATTqOCGCQCCTCTCGAQCTAGCGGCCGC斗TGCATCGATCTCCTACRTCGTATAAATTAGCCTATAOgAAGTT乩TTGCATCTATGTCGGG5pacetyltransferaseandneo
9、mycinphosphotransferaseII,respectively.NLS,nuclearlocalizationsequenee.ThekeysequencesincludingrestrictionsitesforcloningandanalysisofsgRNAexpressioncassettesaregiven.TwoBsaseparatedbyashortenformoftheccdBnegativeselectiongene.I-cuttingstiesBsaI(B-L)
10、andBsaI(B-R)forcloningthesgRNAexpressioncassettesareseparatedbyashortenformoftheccdBnegativeselectiongene.表一pYLCRISPR/Cas9载体新旧命名对应关系新命名原命名适用植物种植物抗性pYLCRISPR/Cas9Pubi-HpYLCRISPR/Cas9-MH,单子叶/双子叶潮霉素pYLCRISPR/Cas9-MTmonopYLCRISPR/Cas9Pubi-BpYLCRISPR/Cas9-MB单子叶/双子叶草甘磷pYLCRISPR/Ca
13、tU6-1，AtU6-29)，用于双子叶植物。ApYLsgRNA-OsU3,-OsU6a,-OsU6bh-OsUSc,-AtU3b,-AIU3CI,-AtU6-1h-AtU6-29/-PUC1SbackbonerjIBamHIsgRNABsaI(2)U-FPpsrgsgR-RHindHIU3AJ6pronnotwnsU3/U6U-fPpsPromoters+7GTTGCAACOsU6bTranscriptioninitiationsitejIsaI(1)dUC1SbackboneBsa(2)*sgRNAuGCCGAGAGACCTTr-GCC
17、pYLsgRNA-AtU3d/LacZ)thathaveanadditionalLacZgene(198bp)asacloningselectionmarker.TheU3andU6promotersfromrice(Os)andArabidopsis(At)andthesgRNAsequeneeareseparatedbythevectorbackbone,toavoidamplificationoftheuncutplasmidsbyPCRwithshortextensiontimedu
18、ringtheconstructionofsgRNAexpressioncassettes.Cutting(smallarrows)withBsaIproducesdifferentnon-palindromicstickyendstothepromotersandanendtothesgRNAsequenee.(C)Arepresentativeregulartargetandanirregulartarget,theirtargetadaptorsfortheOsU6apromoter,andthetr
21、防RNAPolIII将其作为转录终止信号；(4)虽然非特异打靶(脱靶)对植物基因打靶不是很重要的问题，但应进行靶点特异性分析：用靶点+NGG(前后各加几十碱基)与基因组做blast(选Somewhatsimilarsequences)，避免使用与同源序列差异少于5个碱基的靶点(在切点附近和PAM可有2个碱基差异就具有特异性)。可以使用在线软件CRISPR-P(做这个分析，但可使用的靶点序列不一定为Regulartargets(AN19NG或GN19NGG)见以下关于Regulartarget&irregulartarget说明。(5)打算用一个靶序列敲除
23、bp以上的靶序列。3.2靶点接头设计U6/U3基因由III型RNA聚合酶转录，转录起始点是确定的碱基位置。例如，U6为G碱基，U3为A碱基。因此，由U6/U3启动子驱动的sgRNA首碱基一定是G或者A。但是设计的靶序列的首碱基不一定刚好是G或者A,因此设计接头引物时需分两种情况考虑：(1)如果目标区NGG(PAM上游第20碱基是A(用U3启动子)或G(用U6ac启动子)，作为常规靶点(regulartarget），将A/G下游19碱基可按下图所示合成接头。19ntPAM5-NNNNNNNNA/G)NNNNNNNNNNNNNNNNGGNNNNNNNNN-3target19nt合成接头
25、作为非常规靶点（irregulartarget），将20碱基为靶序列合成接头的形式20ntPAM5-NNNNNNNN!NC）NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-320nt合成接头的形式：5-gtcA（T/C）NNNNNNNNNNNNNNNN-NNN（对AtU3b启动子）3-（A/G）NNNNNNNNNNNNNNNNNAAA-5非常规靶点（irregulartarget）接头的形式也就是说，所用启动子的转录起始点与NGGk游第20碱基相同的regular靶点就是合成19碱基+4碱基粘性末端（转录产生的靶点配对序列为A/G+19=20）；不相同的ir
26、regular靶点就是合成20碱基+4碱基粘性末端。对使用拟南芥的AtU3/AtU6启动子的靶点接头也是同样道理，但对接各启动子的粘性末端不同（见Figure3B）。3.3OverlappingPCR法扩增sgRNA表达盒引物设计见4.1.2（与3.2相同目的，自由选择用任一个方案）4.pYLCRISPR/Cas9打靶载体构建原理4.1靶点引物接头与sgRNA表达盒的连接和扩增4.1.1sgRNA构建方法1（接头连接扩增法，与3.2对应）：连接接头后（连接操作见步骤5-5），有3种方法扩增sgRNA表达盒片段（Figure4）:（1）直接用GoldenGa
27、te位置特异引物（TableS1）做一轮PCR扩增。此方案效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。（2）做2轮巢式PCR第一轮PCR用通用的U-F/gR-R做1个反应（引物序列见附录），第二轮PCR用位置特异引物扩增。此方案扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V（注1）。（3）做2轮巢式PCR第一轮PCR故2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gR-R；第二轮为OverlappingPCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。虽然此方案第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V,因此推荐使用此方法。NickTar
31、bonesgRNAregiongR-R1stPCR1stPCRU#T#-Targetsequence(-)Figure5.ProceduresforgenerationofasgRNAexpressioncassettecontainingatargetsequeneebyoverlappingPCR.ThechimericprimerswithtargetsequeneestrandsaregiveninTableS2.ThefirstPCRcanbecarriedoutintwosepar
32、atedreactionswithU-F/U#T#-andgRT#+/gR-Rprimerpair,respectively,orinonereactionwiththeall4primersindicatesagivenpromoter,andT#+andT#-indicatestrandsofatargetsequenee.U#引物设计例子靶点第1碱基与转录起始碱基相同（regulartarget）Targetsequenee转绿起始点GTCGGCCGGCAGCCGGATGCGG19ntgRT#+TCGGCCGGCAGC
33、CGGATGAtttagagctagaaat-3（#为靶点特异编号）OsU6aT#-（下划线与sgRNA配对）OsU6bT#-OsU6cT#-TCATCCGGCTGCCGGCCGCggcagccaagccagca-3TCATCCGGCTGCCGGCCGAaacacaagcggcagc-3TCATCCGGCTGCCGGCCGCtgagcctcagcgcag-3TCATCCGGCTGCCGGCCGAgccacggatcatctgc-3（下划线与OsU6a配对）（下划线与（下划线与（下划线与OsU6b配对）OsU6c配对）OsU3配对）TargetsequenceACAACACGACGACGTC
34、GCCCGGgRT#+OsU3T#-CAACACGACGACGTCGCCTjttttagagctagaaat-3AGGCGACGTCGTCGTGTTGTgccacggatcatctg（下划线与OsU3配对）靶点第1碱基与转录起始碱基不相同（irregulartarget）TGGCAAGGAGTTCCGTTCCTCGG20ntgRT#+TGGCAAGGAGTTCCGTTCCTttttagagctagaaat-3OsU6aT#-AGGAACGGAACTCCTTGCCAggcagccaagccag-3OsU6b,OsU6c,OsU3的配对碱基与上面相同4.4靶标gRNA表达盒排列和扩增
37、te:Pps-GGL/Pg&GGR扩增相应的U#-T1-gRNA2cassettes:Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GGR扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA;3cassettes:Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GG3,Pps-GG3/Pgs-GGFR扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA;4cassettes:Pps-GGL/Pgs-GG2,Pps-GG2/Pgs-GG3,Pps-GG3/Pgs-GG4,Pps-GG4/Pgs-GGFR扩增相应的U#-
38、T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA,U#-T4-gRNA5个或以上靶点：如此类推。4.5靶标sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas载体的连接方法本载体系统可采用GoldenGatecloning(Engleretal.,2008;2009),Gibsonassembly方法(Gibson,etal.,2009,2010)2种策略组装Cas9载体和多个gRNA表达盒片段。GoldenGateligation是利用BsaI(typeIIsrestrictionenzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以
39、设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端(256-16=240种，减去的16种是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种)。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接(如图6,4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接(相同末端分子间也不互补不能连接)，因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU6a-LacZ(AtU3b-LacZ)附有LacZ标记基因(198bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆。BsaISpeI|PB-Lctcgagc(B-L)IGoldenGatecloningMluI.T1*.T2.T
40、3+T4|(B-R)gac|OsUI器gapsytq-gcca=pb-RBsaIFigure6.Generationofa4-targetconstructbyGoldenGatecloning注：由引物Pps-GGL导入载体的唯一SpeI位点是特别留的一个后门”其用途是，在构建好一组目的靶点sgRNA表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点sgRNA表达盒，可以用SpeI将载体切成线状，再用GibsonAssembly将第二组靶点sgRNA表达盒克隆进去。如果连接较多(4个或以上)的sgRNA表达盒的效率低(转化不能获得阳性克隆)，
41、就以连接产物为模板，以引物PB-L/PB-R(见TableS1)扩增岀连接的多个表达盒，再次与pYLCRISPR/Cas9载体酶切连接。5.载体构建操作方法:sgRNA质粒先切后连sgRNA质粒BS粒-连接GoldenGate引物GibsonAssembly引物第二轮PC靶点设计，接（sgRNA方法1）头引物合成sgRNA方法2）*sgRNA表达，*盒连接物1第一轮PCR（每种2反应儿扩增产物（混合）gRNA表达盒gRNA表达盒BsaI切pYLCRISPR/Ca质粒、GoldenGate连接GibsonAssembl连接（边切边连）转化阳性菌落（蓝色），PC
43、直接接种！关键点：pYLCRISPR/Cas9载体较大（约1516.5kb）,拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取纯化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEh公司EndoFreeMaxiPlasmidKit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5g/l）保存。取部分质粒稀释成约100ng/l冷冻保存，作为步骤（10）使用。关键点：由于接下来要用到的
44、BsaI是很容易失活的酶，有时新买的BsaI也是失活的！在进行以下步骤之前，先检测BsaI活性：配制10MBsaI反应液，含有5UBsaI,100ngpYLgRNA-U#（或其它有Amp基因的质粒）。37C反应15min后电泳检查，以未切的相同质粒为对照。pYLgRNA-U#勺BsaI图谱见Figure3。为了尽可能保持酶活性，最好把BsaI分装成几管冷冻保存。NEB公司的BsaI-HF经过修饰以降低星活性，推荐使用NEBBsa-HF和配套的CutSmartBuffersgRNA表达盒构建方法1:（2）靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100凶母液，各取1
47、ATP至终浓度0.51.0mM（此buffer对BsaI和ligase都有效），加入约1020ngpYLgRNA-U#质粒（预先配好20ng/d保存），0.5d接头（最终浓度0.05d）,35UBsaI,15UT4DNAligase。如果实验室没有ATP,在1x内切酶Buffer中加入0.5-1.0d10xNEBT4DNAligasebuffer（10xNEBT4DNAligasebuffer中含有10mMATP，但10xTakaraT4DNAligasebuffer
48、中含有1.0mMATP,因此优先用NEB的）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4DNAligasebuffer缺少KCl或NaCl，不适合BsaI酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：37C5min,20C5min。（5）第一轮扩增：每个sgRNA表达盒分为2个PCR反应，各15d反应体系：取0.5d连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1）,和接头正向引物/gR-R（反应2）,各0.2凶,适量高保真PCR酶。25-28循环：94C10s,60C15s,68C20s。（任意）取4d电泳检
50、：PT1,PT2R3个靶点：PT1,PT2,PT3R;4个靶点：PT1,PT2,PT3,PT4R;5个靶点：PT1,PT2,PT3,PT4,PT5R;6个靶点：PT1,PT2,PT3,PT4,PT5,7个靶点：PT1,PT2,PT3,PT4,PT5,8个靶点：PT1,PT2,PT3,PT4,PT5,PT6RPT6,PT6,PT7RPT7,PT8R取第一轮PCR产物1d用HO稀释10倍，各取1d混合为模板。各表达盒20-50dPCR（1个靶点50d；2-3个靶点各30d；4个或以上靶点各20d）。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15d）。使用适量KOD-
51、Plus或其它高保真PCR酶。扩增17-20循环（实际情况调整）：95C10s,58C15s,68C20s。取2-3d电泳检查产物长度是否符合（注1）,并估计样品的大致浓度。注1:各种启动子gRNA表达盒的长度为勺（括号为BsaI切后）：单子叶表达盒PCF扩增产物长度（bp）BsaI酶切后长双子叶表达盒长度（bp）PCR扩增产物长度（bp）BsaI酶切后长度（bp）LacZ-OsU6a-gRNA831801LacZ-AtU3d-gRNA486456OsU6a-gRNA629599AtU3d-gRNA284254OsU6b-gRNA515485LacZ-AtU
52、3b-gRNA709679OsU6b-gRNA924894AtU3b-gRNA507477LacZ-OsU3-gRNA766736AtU6-1-gRNA487457OsU3-gRNA603573AtU6-29-gRNA502472用PCR产物纯化kit纯化。（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或关键点：此步骤是为了除去DNA聚合酶，以防止下面步骤BsaI酶切产生的粘性末端被补平。sgRNA表达盒构建方法2(OverlappingPCR):（8）取2-5ngpYLgRNA-OsU#质粒为模板，在一个反应中使用4种引物：U-F和gRT#+各0.2d
53、MU#T#-和gRT#+（TableS1）各0.1d。25-28循环：94C10s,58C15s,68C20s。在扩增过程中，开头的若干循环时U-F/U#T#-扩出U#-T#序列，gR-R/gRT#+扩出T#-sgRNA序列。后期的循环中通过overlappingPCR产生2个片段合并的sgRNA表达盒片段。（9）取第一轮PCR产物1d用HO稀释10倍，取1d为模板，按以上步骤（6）进行第二轮PCR组装sgRNA表达盒到pYLCRISPR/Cas9载体（策略I,GoldenGatecloning）:(10)酶切-连接反应试剂加入量
54、（1终浓度10xCutSmartBuffer1.51x10mMATP1.51mMpYLCRISPR/Cas9质粒60-80ng4-6ng/1sgRNA表达盒混合物每表达盒10-15ngBsaI-HF10U0.1-0.2U/T4DNAligase35U2-3U/1H2O最终151注：每个靶点约10-15ng（如1个靶点约10ng、2个靶点共20-30ng、3个共约40-50ng、4个共约60-70ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15ng/片段）。这样载体与每种插入片段摩尔比=1:4-6。用变温循环进行酶切连接约10-15