膀胱癌是中国人常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。据报道，2015年膀胱癌发病率位居中国男性癌症的第7位。与欧美国家相似，国内膀胱癌最常见的病理组织学类型为尿路上皮癌（占91.4%），而鳞状细胞癌（占1.8%）和腺癌（占1.9%）相对少见。膀胱癌在临床上可分为非肌层浸润性和肌层浸润性两大类，其中非肌层浸润性癌的预后相对较好（行根治性膀胱切除术后的5年无病生存率超过80%），而肌层浸润性癌由于无较好治疗手段其预后较差，肌层浸润性癌伴远处转移者的5年生存率仅为8.1%。
一、膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）免疫组织化学检测的一般原则
1.检测适用范围：共识意见建议所有经病理诊断为浸润性尿路上皮癌的膀胱根治标本均有必要进行PD-L1的IHC检测；对于肌层浸润的复发病例以及局部晚期或出现远处转移的病例，如能获得活检标本且有足够的肿瘤细胞时也建议进行PD-L1的IHC检测。
2.膀胱镜活检标本的要求：临床医师取材时应该尽量避开变性、坏死区域，多点活检有助于减少肿瘤异质性的影响，提高检测的准确性。
3.检测方法：IHC方法为检测PD-L1表达的首选方法。PD-L1（SP263）检测目的是评估经3.7%中性甲醛缓冲液固定、石蜡包埋的浸润性尿路上皮癌组织中PD-L1的蛋白表达水平，推荐采用兔抗PD-L1单克隆（克隆号：SP263）并在相应的自动化免疫组织化学染色仪上进行。
二、膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）检测的具体操作规范
2.免疫组织化学检测：
（1）组织切片的准备：选取蜡块时应避开变性、坏死和肿瘤组织少的区域。建议优先选用近期蜡块。未染色的切片如果不能及时行免疫组织化学检测，建议放在4℃冰箱内保存，若放置在室温下不宜超过2周，以防抗原丢失；用于IHC染色切片厚度以4μm为宜。不推荐经过脱钙处理的标本进行PD-L1检测。
（2）评价的目标切片和对照切片：①评价尿路上皮癌PD-L1（SP263）的IHC染色必须制备3张连续切片：HE染色切片、IHC染色阴性对照切片（同型匹配的阴性对照抗体）和PD-L1（SP263）IHC染色切片各1张。②每批次IHC染色要设立阳性对照，阳性对照可采用正常人足月胎盘组织。胎盘组织中的滋养叶细胞对PD-L1（SP263）呈中到强的细胞膜均匀着色和弱至强的细胞质均匀着色，而在间质和血管中不着色。
3.染色质量的判断：如果PD-L1（SP263）的IHC染色质量不符合要求，需要重新染色或者重新选择蜡块（图1）。若出现下述情况之一，需要寻找原因，重新染色：
（1）在HE切片的肿瘤区域中肿瘤细胞<100个；
（2）阳性对照切片染色不合格；
（3）阴性对照切片染色不合格。
图1PD-L1（SP263）染色质量的判断流程
4.结果判读和评分（图2-7）：
（2）IC的范围包括：①在肿瘤区域内成簇聚集的；②在肿瘤反应性间质内聚集的，以及③在相邻肿瘤岛之间侵入肿瘤实质内的免疫细胞。其中在肿瘤反应性间质内聚集的IC区域必须与肿瘤紧密相邻，相邻的肿瘤岛之间的距离不超过一个10倍镜视野宽度（2mm）。IC的种类包括淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和与坏死无关的中性粒细胞。淋巴管内的免疫细胞不计入此范围。
（3）免疫细胞比例（ICP）是IC总面积与肿瘤面积的比值，其比值记为0、1%、5%以及四分位数和十分位数：10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%和100%。如果实际数值在两档之间，按照数学四舍五入方法选取最接近者。如在1%到5%之间，原始数据为2%则归为1%，若为3%或4%则归为5%。如果IC在肿瘤的间质中呈弥漫散在分布，则需要把免疫细胞区域“浓聚”在一起计算面积，而不是“稀释”在间质里连间质区域一起计算。
（4）PD-L1（SP263）IHC染色切片对肿瘤细胞及IC需要分别评估表达情况。
（5）建议在数字扫描切片中进行全片判定。若无法进行切片数字扫描，建议在光学显微镜的4倍或10倍物镜下将肿瘤组织划分多个区域，在10倍或20倍物镜下具体计算各区域肿瘤细胞与IC的表达，经过整张切片的仔细观察，根据各区域百分比及表达情况，计算出肿瘤组织表达数值。
（8）判读标准：PD-L1（SP263）的表达水平由浸润性癌组织中肿瘤细胞和IC阳性比例决定。IC占肿瘤的比例也被用于评估是否存在PD-L1高表达。如果达到下列标准之一，认为存在PD-L1高表达；反之则为PD-L1低表达：肿瘤细胞的细胞膜阳性率≥25%；或当ICP>1%且IC的阳性率≥25%；或当ICP=1%且IC的阳性率=100%。
（9）对于非尿路上皮癌、非浸润性癌（包括原位癌）以及淋巴管内的肿瘤细胞及免疫细胞均不作评价。
（10）若判读的结果接近临界值，建议与其他有判读经验的病理医师再次一起判读。若两人出现判读不一致，建议在更多有经验的判读者之间进行病例讨论。此外如存在固定不佳、坏死区域较多、肿瘤较少或存在其他影响判定的因素时可另选一个蜡块进行IHC染色，并与原来的切片一起进行评价。
图2PD-L1（SP263）判读流程
图3PD-L1（SP263）膀胱尿路上皮癌评分操作流程概述
（1）患者信息：姓名、性别、年龄、患者身份证号码、病理号及临床简要病史。
三、膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）检测的质量控制
质量控制对保证膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）IHC检测结果的准确性具有重要意义。共识意见建议实验室建立严格的质量手册、程序文件、作业指导书和质量记录体系，有完善的内部和外部质量控制和程序验证，并严格执行。从事该项检测的实验室技术人员和病理医师应接受培训和资格考核。建议实验室设置专人负责膀胱癌PD-L1（SP263）检测，对检测仪器和IHC试剂的一致性和稳定性等进行性能验证，常规设立阴性及阳性对照，定期回溯并分析本实验室检测结果，阳性率应保持相对稳定，与国内外报道的研究结果没有显著差异。参加室间质评活动是进行质量控制的有效手段，建议实验室每年至少参加一次全国性或地区级以及其他权威机构组织的培训及室间质评活动，也可通过与其他获资格认证实验室的比对测试方式进行室间质控。全自动IHC染色方法已逐步普及，采用全自动染色方法进行膀胱癌PD-L1（SP263）检测前，染色设备的方案调试和参数设定均需按仪器操作规范完成。
四、小结
作为膀胱浸润性尿路上皮癌免疫治疗重要的伴随诊断和辅助诊断项目，在临床进行免疫治疗前建立规范化的PD-L1（SP263）IHC检测已刻不容缓。本共识意见旨在提出膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）IHC检测的操作及判读规范，更好地为临床用药提供服务和指导，并预测患者对PD-L1免疫抑制剂治疗的反应。在规范化的检测过程中，从标本处理、蜡块选择到IHC染色流程、判读方法以及质量控制均须符合规范要求，才能得到准确的检测结果。