血栓和栓塞性疾病严重威胁着人类的生命健康。纳豆激酶是一种由275个氨基酸残基组成的碱性丝氨酸蛋白酶，其等电点为pH8.6，分子质量为27.7kDa。纳豆激酶具有价格低廉、溶栓活性高、体内半衰期长、特异性强、不易引起出血和过敏反应等优点，是一种新型的天然溶栓活性物质。包埋递送是解决现有纳豆激酶产品胃肠稳定性问题的有效措施。
大连工业大学食品学院的解明浩、徐献兵、杜明*等总结了现有多糖、蛋白质等材料构成的纳豆激酶功能递送载体的研究现状，以期为开发高效、稳定型纳豆激酶溶栓产品提供理论参考。
01
纳豆激酶的结构与功能特性
1.1纳豆激酶的结构特性
纳豆激酶是一种价格低、效率高、无毒副作用、具有强力纤溶活性的碱性丝氨酸蛋白酶。如图1A所示，该酶活性中心位点在Asp32、His64和Ser221处，如图1B所示，与底物结合部位在Ser125、Leu126及Gly127处。纳豆激酶在pH7.0～12.0之间最稳定，低于pH6.0时活性逐渐丧失，最适反应温度为40℃，当温度低于45℃时酶活性相对稳定，高于60℃时由于蛋白质变性导致其活性迅速丧失，反复冻融对该酶活性影响不大。Mg2＋、Ca2＋和Na＋对于纳豆激酶具有明显的激活作用，Fe2＋、Zn2＋、Cu2＋、Ba2＋、Al3＋、Mn2＋及高浓度K＋对其活性有抑制作用。
1.2纳豆激酶的功能特性
纳豆激酶的抗血栓作用
血栓由血管内的不溶性纤维蛋白包裹血小板及血细胞形成。各种体外和体内实验中，纳豆激酶均表现出极强的溶栓活性，且出血风险相对较低。纳豆激酶主要通过4个途径发挥溶栓作用：1）纳豆激酶直接溶栓；2）纳豆激酶刺激尿激酶原转化为尿激酶；3）纳豆激酶刺激血管内皮细胞产生作为内源性纤溶酶原激活剂的组织纤溶酶原激活剂（t-PA），t-PA催化纤溶酶原转变为纤溶酶，从而使积累的纤维蛋白溶解；4）降解纤溶酶原激活物抑制剂，使纤溶酶原被激活为纤溶酶，增强纤溶作用。
纳豆激酶的抗血小板聚集作用
体外研究表明纳豆激酶具有抗血小板聚集作用。纳豆激酶可以显著增加大鼠血小板中的环磷酸腺苷，抑制血小板聚集。纳豆激酶可通过抑制血小板胞浆游离钙离子浓度，降低内皮素-1含量，提高一氧化氮含量，降低血小板颗粒膜蛋白和血管性血友病因子水平，抑制血小板聚集。
纳豆激酶的降血压作用
灌胃纳豆激酶和高血压临床药物卡托普利可有效降低自发性高血压大鼠收缩压和舒张压。临床评估纳豆激酶对北美高血压人群血压影响的研究显示，口服2000FU/d纳豆激酶8周后，受试者舒张压平均下降0.40kPa，其中男性受试者舒张压下降较明显，为0.67kPa。无论完整形式还是片段的纳豆激酶都可以从肠道吸收并降低自发性高血压大鼠的血压。然而，根据口服给药形式的不同，降压作用机制不同。纳豆激酶保留其蛋白酶活性时，可通过切割血浆纤维蛋白原降低血液黏度来降低血压；从纳豆激酶获得的片段可通过降低血浆血管紧张素II水平来抑制高血压。
纳豆激酶的降血脂作用
纳豆激酶可降低患者胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平，但是其降幅仅为辛伐他汀组的50%左右。研究结果显示，每天服用纳豆激酶可以有效控制颈动脉粥样硬化的发展，且效果比辛伐他汀更明显。说明纳豆激酶在管理动脉粥样硬化上可能是比他汀类药物更好的选择。
纳豆激酶的抗凝作用
纳豆激酶应用的局限性
纳豆激酶是一种碱性蛋白酶，口服后必须途经胃肠道被小肠上皮细胞吸收进入血液，并运输到全身循环后才能发挥其溶栓作用。胃中的胃蛋白酶和低pH值环境会破坏纳豆激酶的空间结构，使其失去纤溶活性，而肠道中的消化环境比胃中的消化环境温和。如果口服纳豆激酶，必须确保其在消化系统中的稳定性，以达到溶栓的目的。包埋技术是使纳豆激酶在胃内稳定并在肠内缓慢释放的有效方法。
02
纳豆激酶包埋递送系统
目前在纳豆激酶递送系统中使用较多的壁材包括多糖、蛋白质等材料，可以分为如图3所示的不同类型纳豆激酶递送系统。
2.1脂质体
脂质体是由一个或多个同心磷脂双层构成微囊结构的载体制剂，其结构类似于细胞膜，具有高生物相容性、低毒性和低免疫原性。脂质体独特的结构特性。使其能够封装水溶性、油溶性和两亲性物质，两性分子分散于水相时形成具有双分子层结构的封闭囊泡，其亲水头部暴露在水相中，而疏水尾部聚集在一起，在双分子膜内和囊泡内水相能够包裹多种不同极性的活性成分。脂质体能够提高化合物的稳定性、克服细胞和组织摄取障碍、增加药物在体内靶点的生物分布，同时最大限度地降低全身毒性，从而提高药物的治疗效果。脂质体中的胆固醇为磷脂双分子膜提供刚性的成分并改善双层膜的性能，但对于高胆固醇血症患者，即使是低浓度的胆固醇也应严格限制摄入。植物甾醇可以通过抑制胆固醇从小肠的吸收而有效降低血浆中的胆固醇浓度，其功能和化学结构与磷脂双分子膜中胆固醇相似，且在制备脂质体时用植物甾醇代替胆固醇是可行的。脂质体包埋纳豆激酶有利于破坏血栓，尤其是高脂血症引起的血栓。
2.2多糖
海藻酸钠
环糊精
环糊精是通过淀粉酶促降解作用得到的一系列天然多糖，通常是由α-1,4糖苷键连接6～8个D-吡喃葡萄糖单元形成，分为α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。环糊精具有亲水性外缘和疏水性内腔，呈现出锥型中空圆筒状立体结构，这使其可以通过疏水相互作用、范德华力、氢键或主客体相互作用包埋各种客体分子。环糊精具有制备简单、价格低廉、易于包埋等优点，其中极性较低的疏水腔可以嵌入各种小分子和蛋白质。
其他多糖
将阿拉伯树胶和明胶混合制备纳豆激酶微胶囊，其包埋率达到93.91%。采用复凝聚法利用羧甲基纤维素和明胶制备纳豆激酶微胶囊，其耐酸性较原始纳豆激酶液明显提高。用交联技术将纯化的纳豆激酶通过壳聚糖与三聚磷酸钠离子凝胶化，然后与戊二醛交联来制备稳定的负载纳豆激酶的壳聚糖纳米粒子。与游离纳豆激酶相比，负载纳豆激酶的稳定壳聚糖纳米颗粒在口服后显示出更好的稳定性，且其抗血栓生物活性增强。
2.3蛋白质
蛋白质具有较好的溶解性、乳化性、凝胶性、起泡性、持水性、生物相容性和降解性。因其所形成的凝胶具有良好的pH值敏感性、可控的通透性和较高的凝胶强度，已被广泛用于各种生物活性成分的包埋。蛋白质能够通过酶、酸以及钙离子的交联作用在室温下形成结构致密的凝胶，且该反应条件温和，有利于对热敏感的生物活性成分进行包埋。基于以上特性，蛋白质成为极具应用前景的纳豆激酶包埋壁材。目前常用的单一蛋白质壁材包括大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、乳清蛋白、酪蛋白和明胶。
2.4其他材料
γ-聚谷氨酸
γ-聚谷氨酸是一种阴离子天然聚合物，其易溶于水、生物相容性好、可生物降解、可食用且对人体无毒。γ-聚谷氨酸是由D-谷氨酸、L-谷氨酸通过γ-酰胺键结合形成的一种多肽分子，它包含500～5000个谷氨酸单体，是纳豆中黏性物质的主要成分。有研究将纳豆激酶包埋在高分子质量的钠-γ-聚谷氨酸微胶囊中。虽然制备的微囊在模拟胃环境中的稳定性不高，并且超过95%的酶活性丧失，但纳豆激酶的贮存稳定性得到了改善。
虫胶
虫胶是一种天然、可生物降解和可再生的昆虫源树脂，它具有低透水性的优点。有研究将纳豆激酶与虫胶溶液混合并加入氯化钙交联溶液中，形成嵌入酶的固体虫胶颗粒。结果表明，使用虫胶包埋纳豆激酶的包埋率为87.2%，虽然包埋率与氯化钙浓度无关，但酶的活性随着氯化钙浓度的增加而降低。
聚羟基丁酸
聚羟基丁酸（PHB）是由细菌合成的短链聚合物，具有生物相容性高、生物可降解、无刺激性、无免疫原性和组织相容性高等特殊性能。其可用于包埋蛋白质类活性物质以达到缓释的效果，保护未释放的蛋白质不被降解。
多重自乳化给药系统
多重自乳化给药系统是油包水型乳液和亲水性乳化剂的混合物在胃肠条件或常温轻度搅拌条件下用水稀释后自乳化而成的水/油/水（W/O/W）复合乳液，可以避免胃肠道中肽和蛋白质药物的失活和酶降解。与其他制剂相比，该系统药物的吸收和药理活性显著提高。
多巴胺涂层的聚苯乙烯微球
有研究通过多巴胺在聚苯乙烯微球上的氧化聚合制备微胶囊，然后将纤维蛋白原固定在聚多巴胺层的表面上，随后利用四氢呋喃去除核心获得微胶囊，纳豆激酶通过扩散加载到微胶囊中。该研究中纳豆激酶的包埋率接近75%，其盐水溶解活性和凝血指数证明所制备的微胶囊具有很高的抗血栓活性。
异丁烯酸-丙烯酸乙酯共聚物EudragitL100-55
使用pH值敏感的肠溶材料EudragitL100-55以及环境友好型的超临界CO2流体替代传统有机溶剂制备纳豆激酶的肠溶微球。该材料不溶于酸性介质，但可溶于pH5.5以上的介质，因此其能帮助药物抵抗胃酸的作用，而在中性或微碱性环境中迅速溶解，使药物得以快速释放。体外实验结果表明，载药微球在模拟胃酸（pH1.2）环境中2h仅释放9.7%，并能保持近90%的活性状态，在模拟肠液（pH8.6）中4h内快速释放90%。
磁性纳米颗粒
将磁性Fe3O4纳米颗粒嵌入聚乳酸层中，之后将由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸（RGD）组成的序列接枝到树状大分子上以合成Fe3O4-（4-PLA(G3)4）-RGD纳米颗粒，最后将纳豆激酶包埋进纳米颗粒中。在外部磁场的影响下，纳米颗粒可以用于靶向溶栓，这可以减少纳豆激酶注射的有效剂量，增加其生物靶点的局部浓度，并能促进纳豆激酶在人体内的局部递送。
聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物
通过双乳液蒸发法，以聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PEG-PLGA）和叶酸-聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（FA-PEG-PLGA）作为壁材制备纳豆激酶微胶囊。体外模拟缓释结果表明，经胃环境（pH2.0）作用2h后，两种微胶囊中超过60%的纳豆激酶被保留，经肠环境（pH7.0）作用22h缓释效果良好。FA-PEG-PLGA纳豆激酶微胶囊表现出更好的吸收效果。有研究建立了Caco-2单层细胞模型，研究纳豆激酶微胶囊体在Caco-2细胞内的转运吸收效果。通过结果推测所制备的微胶囊易形成纳米胶束，其颗粒小且兼有PEG与PLGA的亲水和疏水性以及良好的生物相容性，从而促进了纳豆激酶微胶囊在小肠细胞中的吸收。PEG-PLGA及FA-PEG-PLGA两种纳豆激酶微胶囊无明显细胞毒性，在Caco-2单层细胞中均有很好的吸收效果；PEG-PLGA纳豆激酶微胶囊的主要吸收方式为被动扩散；FA-PEG-PLGA纳豆激酶微胶囊的主要吸收方式为被动扩散，此外还可能存在叶酸载体介导的主动转运，进而促进其在Caco-2细胞中的吸收。该研究为通过叶酸靶向作用促进纳豆激酶的细胞吸收、提高纳豆激酶口服利用度提供了依据。
聚谷氨酸肽树状聚合物
03
结语
目前，已有动物实验和临床试验证明纳豆激酶能够口服通过小肠吸收进入到血液循环中，但是对于其具体的吸收利用机制尚未完全阐明，纳豆激酶与小肠上皮细胞的结构和性质之间的关系有待深入研究。纳豆激酶在肠液中的释放及其体内吸收可能部分依赖于胰酶对纳豆激酶的部分降解，且降解产生了大量相对分子质量不等的片段，这些片段仍然具有纤溶活性，而且可能是纳豆激酶体内吸收的一个重要形式。筛选出具有纤溶活性的片段递送进入人体发挥溶栓作用是值得深入研究的课题。
纳豆激酶功能递送载体可以保护纳豆激酶在胃内不被降解并在肠内稳定释放，发挥其溶栓作用，但现有的纳豆激酶功能递送载体存在缺点。脂质体独特的结构特性使其能够包裹水溶性、油溶性和两亲性物质。然而，只有少数研究聚焦纳豆激酶脂质体的制备。已有研究表明脂质体共包埋薏苡籽油和β-胡萝卜素比负载单一生物活性物质的脂体具有更高的抗癌和抗氧化活性。未来可以制备与其他活性物质共包埋的纳豆激酶脂质体，并探索其是否是一种提高纳豆激酶稳定性和溶栓活性的新方法。用于乳液递送系统的表面活性乳化剂通常有毒，且稳定性较差，容易分层和絮凝。未来可以开发新的食品级乳化剂，或对乳液进行改性。单一多糖类或蛋白质类壁材制备的功能递送载体在贮存和递送方面会有一定的限制，而与其他物质复配后形成复合壁材能够弥补单一壁材的缺点，提高包埋效率和保护效果，未来可以寻找更合适的复配材料，以制备稳定、包埋率高且保护效果好的纳豆激酶功能递送载体。
：中国农业大学李媛教授等：提高益生菌耐加工贮藏稳定性和体内存活率的递送系统研究进展