目前，开发针对EV-D68感染的疫苗主要采用两种方法：重组病毒样颗粒（VLP）疫苗（需要在酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞中生产）和灭活疫苗（今年在荷兰进入临床试验）。采用这两种方法开发EV-D68疫苗从研发到上市获批需要耗费数年，新出现的EV-D68变种很可能会逃脱这些疫苗提供的免疫。新冠mRNA疫苗的成功上市，使得人们看到基于mRNA技术的传染病疫苗在研发和上市中迸发出来的巨大的速度优势。
01
EV-D68自复制RNA疫苗抗原设计
肠道病毒（Enterovirus）是一类小型、无包膜的单股正链RNA病毒。肠道病毒的ORF首先翻译出一个前体蛋白，经过加工生成P1、P2、P3三种蛋白，其中P1经过病毒蛋白3CD切割生成肠道病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3，VP0可再裂解成VP2和VP4，P2和P3经过2A蛋白酶和3C蛋白酶水解后最终形成7种非结构蛋白。由于肠道病毒基因组编码的RNA依赖的RNA聚合酶具有高度易错性，因此肠道病毒能快速突变、具有高度的适应性。
在昆虫和酵母细胞中，共表达肠道病毒P1和3CD蛋白，那么3CD裂解P1多肽产生VP0、VP1和VP3衣壳亚基蛋白组成VLP，并且在动物体内触发中和抗体反应。随后，有人用编码P1-3CD的腺病毒载体疫苗在小鼠体内成功触发中和抗体反应。最近，还有人在P1多蛋白的衣壳亚基之间结合了核糖体跳跃基序，从而可以在体外成功生成VLP。
基于上述研究，优化自复制RNA共表达P1和3CD时，研究人员发现脑心肌炎病毒IRES驱动P1下游的3CD表达时要比T2A驱动的在细胞水平产生更多的VLP，在体内也会触发更加有效的中和抗体反应。
接下来，研究人员想知道共表达3CD是否是小鼠体内触发有效免疫反应所必须的？为此，他们构建了4种自复制RNA疫苗：
·P1IRES-3CD:共表达P1和3CD;
·P1△3CD：只表达P1;
·P1T2A：在每个衣壳亚基之间插入T2A序列；
·VP1HA2:VP1与流感血凝素HA2结构域融合，使VP1能够分泌并束缚在细胞表面。
将上述4种自复制RNA构建体转染BHK细胞，结果发现，只有P1IRES-3CD转染的细胞裂解物才能够检测到预期大小的VP1WB条带，其他3种自复制RNA构建转染细胞产生的VP1条带均出现不同程度的迁移。在体内，只有P1IRES-3CD自复制RNA疫苗免疫小鼠血清中检测到中和抗体反应，其他三种自复制RNA疫苗免疫小鼠血清均无法触发有效的中和抗体反应。在攻毒试验后，只有P1IRES-3CD自复制RNA疫苗才能够为小鼠提供充足的免疫保护，预防病毒入侵肺部组织。这些数据表明EV-D68自复制RNA/LION疫苗在抗原设计时共表达P1和3CD是在小鼠体内触发免疫保护效果所必须的。
02
EV-D68抗原多样性和异源免疫
肠道病毒D68（EV-D68）表现出显著的抗原多样性，分为A、B和C三个主要进化枝，这是其传播动态和疫情出现的关键因素。EV-D68的抗原多样性给疫苗开发带来了挑战，研究人员构建了6种不同抗原亚型的自复制RNA疫苗，免疫小鼠，测定其触发的同源抗体和异源抗体血清滴度。编码A1/A2病毒株的自复制RNA疫苗免疫原性最差，而编码B1/B2毒株的自复制RNA疫苗广谱性最好。从另外一个角度来说，在B分支内，尽管B1、B2和B3分支之间的抗原氨基酸差异很大（13至20个氨基酸差异），但这些毒株的逃逸程度极低。相反，对于A1和C进化枝，毒株抗原氨基酸差异很小（分别是两个和五个氨基酸差异），但触发的中和抗体反应差异很大。
B1-repRNA疫苗免疫小鼠，B1MA攻毒试验后，采集腔和肺部组织，检测活病毒载量。与对照组相比，接种B1-repRNA疫苗的小鼠鼻甲中检测到病毒载量显著下降，而且，在肺部未检测到病毒。采用0.1ug或者1ugB3-repRNA疫苗免疫小鼠，B1MA异源攻毒试验后，不同剂量免疫组小鼠鼻甲或者肺部中检测到病毒载量无明显差异，相反，B3同源病毒攻击后，高剂量免疫组小鼠甲或者肺部中检测到病毒载量明显更低。这表明更高的剂量和同源型疫苗可提供更加有效的免疫保护。
采用A1/B1/C自复制RNA疫苗或者RSV疫苗（阴性对照）免疫小鼠，在B1MA攻毒后，测定血清中的B1MA特异性的中和抗体滴度。只有B1自复制RNA疫苗同源免疫触发了非常显著的中和抗体反应。对于异源免疫来说，C自复制RNA疫苗触发了较低的交叉免疫，而A1自复制RNA疫苗免疫小鼠血清未检测到中和抗体滴度。用B1MA感染小鼠鼻腔，24h后，测定小鼠肺部和鼻腔的病毒载量和应对感染的宿主免疫反应。与中和抗体结果一致，只有B1自复制RNA疫苗同源免疫才能提供充足的免疫保护。利用RNA-seq技术检测肺部组织免疫前后的宿主基因表达情况，与B1/C自复制RNA疫苗触发的针对B1MA的免疫保护存在差异不同，两组疫苗免疫小鼠在应对B1MA病毒感染时宿主基因表达趋势相同。同时，两组疫苗免疫小鼠的巨噬细胞和中性粒细胞丰度也无差异。许多细胞因子、趋化因子和干扰素刺激基因与呼吸道病毒性疾病的发病机制有关，包括由EV-D68引起的疾病，然而，这些基因的表达水平在B1或者C自复制RNA疫苗组中无差异并且明显低于RSV疫苗免疫对照触发的水平。
03
EV-D68自复制RNA疫苗递送载体触发的免疫差异
研究人员采用1ug/10ug不同剂量的B2-repRNA-LNP和B2-repRNA-LION疫苗分别免疫小鼠。在B1MA攻毒后，B2-repRNA-LION疫苗剂量的增加导致血清中和抗体滴度明显增加，但是，对于B2-repRNA-LNP疫苗来说，不同剂量、初始-加强免疫前后的血清中和抗体滴度并无显著差异。而且，相同剂量的B2-repRNA-LNP和B2-repRNA-LION疫苗触发的血清抗体滴度水平是相似的。然而，就保护效果而言，相比LNP制剂，LION制剂免疫小鼠上呼吸道病毒载量显然更低。
04
EV-D68自复制RNA疫苗触发抗体的被动免疫效果
确定repRNA/LION诱导的抗体反应是否足以在体内预防EV-D68诱导的神经系统疾病。
将B2-repRNA-LION疫苗免疫小鼠的血清转移至7天大的I型干扰素受体敲除(Ifnar1)小鼠体内进行被动免疫，可触发有效的中和抗体反应。与流感疫苗或者PBS对照组相比，在B2病毒攻毒后，接受B2-repRNA/LION血清被动免疫的小鼠体重未减轻，存活率正常，未发生神经缺陷。然而，PBS对照组攻毒试验后8天小鼠全部死亡，而且，流感疫苗或者PBS对照组小鼠的运动障碍范围从双侧后肢松弛麻痹到完全四肢瘫痪。因此，B2-repRNA-LION疫苗诱导的抗体反应足以在体内预防EV-D68诱导的神经系统疾病。
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EV-D68自复制RNA疫苗在恒河猴模型中的免疫保护效果
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总结
包膜病毒已经进化出复杂的策略，通过利用宿主细胞的分泌途径产生结构蛋白和释放病毒颗粒，为疫苗开发带来了挑战和机遇。迄今为止，无包膜病毒疫苗的开发主要集中在减毒活疫苗、灭活疫苗或基于重组蛋白的方法上。所有这三种方法的共同点是成功引发针对疫苗病毒（减毒活或灭活）表面或VLP（重组蛋白）表面上存在的构象表位的中和抗体反应。尽管在接种衣壳亚基（例如VP1）后可触发中和抗体反应，也可检测到针对线性表位检测到的中和单克隆抗体，但是病毒表面存在的构象表位抗原会诱导更强烈和广泛反应性的多克隆反应。
在本研究中，研究人员将上述积累的经验纳入针对无包膜病毒EV-D68的自复制RNA/LION疫苗设计中，发现只有共表达P1和3CD才能在小鼠体内触发强烈的中和抗体反应。EV-D68具有多种亚型毒株，异源免疫虽无法提供完全的免疫保护，但是能减轻宿主在应对病毒感染时的炎症反应。与LNP制剂疫苗相比，LION制剂疫苗似乎可以更好地控制上呼吸道EV-D68的感染。基于EV-D68自复制RNA/LION疫苗免疫小鼠血清抗体的被动免疫可预防EV-D68诱导的神经系统疾病。最后，在恒河模型中，EV-D68自复制RNA/LION疫苗可触发非常广泛的中和抗体反应。
参考文献
[1]WarnerNL,ArcherJ,ParkS,SinghG,McFaddenKM,KimuraT,NicholesK,SimpsonA,KaelberJT,HawmanDW,FeldmannH,KhandharAP,BerglundP,VogtMR,ErasmusJH.Aself-amplifyingRNAvaccinepreventsenterovirusD68infectionanddiseaseinpreclinicalmodels.SciTranslMed.2024Aug7;16(759):eadi1625.doi:10.1126/scitranslmed.adi1625.