2024-02-0718:01发布于江苏科学领域创作者
引言
现代生物学研究中，准确地量化RNA和DNA分子至关重要，尤其是在单细胞测序和癌症基因组学等领域。独特分子标识符（UMI）是一种革命性的技术，它通过为每个分子附加一个独特的序列标签来实现这一点。这种方法可以有效地消除PCR扩增过程中的偏差和错误，从而提供更准确和可靠的数据。通过使用UMI，研究人员能够对测序样本中的每个原始分子进行精确计数，从而大大增强了数据的质量和解释力。
尽管UMI技术在提高测序数据质量方面取得了显著进展，但PCR扩增过程中引入的错误依然是一个挑战。这些错误不仅会增加假阳性率，还会影响到UMI的准确识别，从而对数据的解读造成影响。因此，如何有效识别和校正这些错误，成为了提高测序准确性的关键。
2024年2月5日发表于Naturemethods（IF47.99）上的研究“CorrectingPCRamplificationerrorsinuniquemolecularidentifierstogenerateaccuratenumbersofsequencingmolecules”提出了一种新的方法，通过采用同源三聚体核苷酸块来设计UMI，有效地减少了PCR扩增过程中的错误。这种设计不仅提高了UMI的稳定性和准确性，还为高通量测序技术提供了一种新的解决方案。研究结果表明，这种新型UMI能够在不同的测序平台上提供更为准确的测序数据，为今后的基因组学研究和临床应用开辟了新的道路。
独特分子标识符（UMI）的设计与合成
UMI的基本原理及其在序列分析中的应用
独特分子标识符（UMI）是一串能够唯一标记单个分子的随机序列，它使得科研人员能够在高通量测序过程中区分和量化每一个原始分子，即使在经过PCR扩增之后。这一技术极大地提高了测序数据的准确性，使得从单细胞测序到复杂样本分析的各种应用都变得更加可靠和精确。
采用同源三聚体核苷酸块设计UMI
为了进一步降低PCR扩增过程中引入的错误，该研究采用了一种创新的UMI设计策略——同源三聚体核苷酸块。这种设计利用了三个连续相同的核苷酸作为UMI的基本单位，以增强UMI在测序和数据分析过程中的稳定性和可辨识度。同源三聚体的结构设计不仅能够有效减少由于PCR或测序错误导致的误识别，还可以通过简化错误校正算法来提高数据处理的效率。
使用基于同源三聚体UMI的方法提高大规模mRNA测序的准确性，以减少PCR引起的错误（Credit:Naturemethods）
合成方法与实验验证
该研究中UMI的合成采用了固相合成技术，通过精确控制化学合成过程，确保了UMI序列的高度一致性和纯度。合成完成的UMI经过一系列的生物化学实验进行验证，包括PCR扩增稳定性测试、测序准确性分析以及与传统UMI设计的比较实验。结果表明，采用同源三聚体核苷酸块设计的UMI在减少PCR扩增错误、提高测序数据准确性方面表现优异，验证了这一设计策略的有效性和应用潜力。
PCR扩增错误的检测与校正
PCR错误类型及其对UMI准确性的影响
在高通量测序技术中，PCR扩增是不可避免的步骤，其目的是增加样本的数量以满足测序需求。然而，PCR扩增过程中容易引入错误，包括错配、插入和缺失等，这些错误会直接影响到UMI的准确性和测序结果的可靠性。特别是在需要高度精确的单细胞测序和低丰度样本分析中，PCR错误的影响尤为显著。
同源三聚体UMI的错误检测方法
为了有效检测和减少PCR引入的错误，该研究采用了同源三聚体UMI设计。这种方法基于一个简单的原理：通过分析三聚体内的同质性，可以有效地识别和校正那些由PCR引起的随机错误。具体来说，如果在一个三聚体内出现两个或三个相同的核苷酸，则可以认为该位置没有错误，或者错误已被自然校正。如果三个核苷酸全不相同，则该位置很可能发生了PCR错误，需要进一步的校正处理。
错误校正策略与效率评估
针对检测到的错误，该研究开发了一套高效的错误校正策略。这套策略包括两个关键步骤：首先，对于每个UMI，通过比较其所有可能的三聚体组合，识别出错误最少的序列作为正确的UMI序列；其次，利用这个正确的UMI序列来替换原始数据中所有相应的错误UMI，从而实现错误的校正。通过这种方式，不仅能够有效降低由PCR错误引入的假阳性率，还能够显著提高数据分析的准确性和可靠性。
该研究中，错误校正的效率通过一系列实验进行了评估。实验结果显示，采用同源三聚体UMI的错误检测与校正策略，相比传统UMI设计，能够更有效地减少PCR错误，提高UMI的准确性。这一发现对于提升高通量测序数据的质量具有重要意义，尤其是在那些对数据准确性要求极高的应用场景中。
同源三聚体UMIs在单细胞测序中提高差异表达的准确性（Credit:Naturemethods）
UMI技术的改进和优化仍有广阔的空间。未来的研究可能还可以从以下几个方面进行探索：首先，进一步优化UMI的设计，包括探索不同的核苷酸块组合和长度，以适应更广泛的测序应用需求；其次，开发更高效的错误检测和校正算法，提高数据处理的速度和准确性；最后，加强UMI技术与各种测序平台的兼容性研究，确保其在不同测序环境下的稳定性和可靠性。