如有意见和建议，请填写意见反馈表（附件2），以电子邮件的形式于2022年12月2日前反馈至我中心。邮件主题及文件名称请以“《重组人源化胶原蛋白原材料评价指导原则（征求意见稿）》意见反馈+反馈单位名称”格式命名。
联系人：郭晓磊，刘文博
联系方式：010-86452815；010-86452675
附件：
1.重组人源化胶原蛋白原材料评价注册审查指导原则（征求意见稿）
2.意见反馈表
国家药品监督管理局
医疗器械技术审评中心
2022年11月7日
附件1：
重组人源化胶原蛋白原材料评价指导原则
（征求意见稿）
表7水溶解性/盐溶解性
表1宿主细胞基本特征信息表
表2宿主细胞鉴定项目
图1工程细胞构建一般流程
表3工程细胞鉴定项目
表4衡量目的基因质量的项目
检查项目
检测方法
质量标准
目标序列
DNA测序
测序结果正确
限制性酶切
核酸电泳法
插入片段大小正确，无预期外片段
DNA质量
紫外分光光度扫描
OD260/280=1.8~2.0
图2完整的质粒信息示例
表5目的基因序列插入质粒过程中的主要质控参数举例
限制性酶切验证
表6目的蛋白表达稳定性分析
表达稳定性
SDS-PAGE电泳考染法
与供试品一致
含量
不低于初始工程菌
污染检测
显微镜检测、支原体检测试剂盒
无污染
目前常用的方法有细胞生长特征和培养形态学检查、种属特异性抗原检测、染色体核型分析、同工酶分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。应结合具体细胞固有的特性进行适宜的组合和选择，以实现正确鉴别为目的。
真核细胞用于生产时，细胞的鉴别标志，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特征，对鉴别所建立的种子是有用的。有关所用传代细胞的致癌性应有详细报告。如采用微生物培养物为种子，则应叙述其特异表型特征。
需检测分析目的基因引入细胞后的致瘤性特征，对于阳性细胞，应研究确定致瘤性改变对胶原蛋白材料带来的安全性风险。种子批不应含有外源致癌因子。
目的基因和表达框架的确证是种子库细胞检定的重要组成部分，对于表达正确的目的产物具有先决性意义。常用的方法包括：通过PCR扩增样本DNA来进行DNA序列分析；通过限制性内切酶谱和Southern杂交来检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，并检测是否有任何序列插入或缺失等。
基因序列分析资料应包括试验方案和步骤、原始的测序图、测得序列以及翻译后的氨基酸序列，同时应将实际测得序列与理论序列进行对比。清楚标注两者之间的异同。一般情况下，在原始种子阶段应确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，例如传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列分析。在此情况下，可采用总细胞DNA的杂交印染分析，或作mRNA的序列分析。对最终胶原蛋白材料的特征鉴定应特别注意。
为保证胶原蛋白材料结构的正确和稳定，基因序列分析应贯穿于重组工程细胞的筛选和鉴定、细胞库的建立和检定以及生产细胞培养监控的全过程。
2.3.2微生物污染检测
应对MCB、WCB和EPC（生产终末期细胞）进行全面检查，对生产培养过程中的细胞进行监测。在进行支原体检查时，应注意同时进行培养法和指示细胞法两种方法。必要时可采用扫描电镜法检查细胞是否受到特殊微生物的污染。
2.3.2.2.1体外试验
2.3.2.2.2体内试验
通过接种乳鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、家兔或其它敏感动物来检测细胞培养物中潜伏性病毒。通常要对MCB、EPC进行体内试验。
2.3.2.2.3种属特异性病毒的检定
2.3.2.2.4逆转录病毒的检测
逆转录病毒的试验应包括感染性试验、逆转录酶(RT)检测和电镜技术检查。应采用上述方法对MCB和EPC细胞进行逆转录病毒的检测。
2.3.2.2.4.1感染性试验
应根据细胞的特性及可能存在的逆转录病毒种类选择适宜的检测方法，如XC空斑试验（XCplaque）、延时XC空斑试验、S＋L－灶点分析（S＋L－Focus）等。试验时应注意设立恰当的阴/阳性对照。
2.3.2.2.4.2逆转录酶检测
为提高检测的敏感性，通常需要将受试细胞经适当的化学诱导剂诱导后，收集上清液分别与检测细胞联合培养，再检测逆转录酶的活性，注意设立恰当的阴/阳性对照。
2.3.2.2.4.1透射电镜检查
透射电镜下可观察细胞基质超微结构的形态学特征以及逆转录病毒和病毒样颗粒的存在，应比较未经和经过化学诱导剂诱导的细胞。另外，需要对细胞培养液超速离心后所得的沉淀物经负染后进行检查。观察有无逆转录病毒颗粒以及颗粒的类型。
上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，如果确证对人或者其它灵长类动物细胞有感染性的逆转录病毒颗粒，该细胞不可用于生产。
2.4细胞稳定性研究
2.4.1贮存条件下的稳定性
2.4.2传代/扩增过程中的稳定性
目的基因编码序列和表达框架不应有错误，包括突变、缺失、插入。并注意比较基因拷贝数的变化。
目的产物的表达量和表达活性不应有明显降低，根据不同的重组人源化胶原蛋白和具体研究结果确定适宜的可接受标准。
应重点检测细胞在传代/扩增过程中的形态、生长、代谢等基本状况，遗传特征和致肿瘤特性的变化。
2.5生产过程细胞质量控制
对于内源性逆转录病毒和/或致瘤性试验阳性的细胞，应依据工艺处理能力制定风险性成分的控制条件，并根据模拟生产状态下取得的试验研究数据制定废弃收获液的标准；生产工艺须包括有效的病毒和/或致瘤性成分的灭活/去除方法并经过充分验证。
2.5.1常规生产过程监控
经研究确定了生产工艺条件之后，常规生产过程中可重点监测微生物污染和细胞生长状况，例如活细胞数目和形态、代谢和功能状态、目的蛋白表达状况、潜伏性逆转录病毒基因组激活状况、细菌和支原体污染以及其它要求等，在比较分析的基础上确定批次或者连续培养生产的终末细胞的检测项目及可接受标准。
2.5.2细胞增殖限度
2.5.3其它风险性因素控制
2.6风险评估与控制
随着技术不断更新和研究经验的逐步积累，研发过程常常伴随重组人源胶原合成表达系统的升级和工艺的优化，因此研发各阶段有可能发生变更。系统的变更可能显著影响工程细胞的安全性和有效性，是重要风险之一，研发者需评估变更引入的影响和风险。根据风险评估情况，对重组人源胶原合成表达系统及其工程细胞的质量、工艺控制、稳定性等方面进行深入研究，合理设计变更可比性研究方案。
二、常规生产过程控制
重组胶原蛋白的结构特性容易受到各种理化因素的影响，且分离提纯工艺复杂，因此其质量控制体系是针对生产全过程，采用化学、物理和生物学等手段而进行的全程、实时的质量控制。生产过程中每一环节或制备条件的改变均可能影响其非临床安全性评价的合理性。
1.制备工艺
2．发酵
2.1有限代次生产
用于培养和诱导基因产物的材料和方法应有详细资料。培养过程及收获时，应有敏感的检测措施控制微生物污染。
需提供培养生长浓度和产量恒定性方面的数据，并应确立废弃一批培养物的指标。根据宿主细胞／载体系统的稳定性资料，确定在生产过程中允许的最高细胞倍增数或传代代次，并应提供最适培养条件的详细资料。
在生产周期结束时，需监测宿主细胞/载体系统的特性，例如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。一般情况下，用来自一个原始细胞库的全量培养物进行监测，必要时应做一次目的基因的核苷酸序列分析。
2.2连续培养生产
基本要求同2.1有限代次生产。
需提供经长期培养后所表达基因的分子完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因型特征。每批培养的产量变化应在规定范围内。对可以进行后处理及应废弃的培养物，应确定指标。从培养开始至收获，应有敏感的检查微生物污染的措施。
3．纯化
根据生产工艺需求，可以将纯化过程分为粗纯、精纯、换液、浓缩等工序，关于纯度的要求可视胶原蛋白材料的用途和用法而确定。例如，仅使用一次或需反复多次使用时，用于健康人群或用于重症患者时，都可对纯度有不同程度要求。不同载体细胞表达系统可能对纯化过程的要求有所不同，但所采用的分离、纯化、浓缩方法或技术，应能适用于规模化生产并保持稳定。
对于生产过程中的收获、分离和纯化方法应详细记述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除，如采用亲和层析技术，例如用单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。应验证这些分离、纯化关键工序及杂质检测方法。对整个纯化工艺应进行全面研究，包括对宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它杂质以及在纯化过程中加入的有害的化学物质等的去除。可以采用过滤、离心等操作进行分离，通过洗滤参数、相对离心力等工艺参数进行必要的控制；可以采用蛋白层析或者离子交换层析等技术进行纯化。
换液可将蛋白溶剂置换至工艺要求的工作液中，浓缩将蛋白浓缩至工艺要求的浓度。质控点通常包括膜截留效率、蛋白含量、电导率等。
应建立重组人源化胶原蛋白原材料成品的鉴别、纯度、稳定性和活性等方面的试验方法，详见正文“二、（一）重组人源化胶原蛋白原材料性能研究”。对生产过程中的原液、半成品及生产原辅料，应注意如下方面。
3.1原液要求
原液的检测项目可包括蛋白表征研究（如肽段覆盖率、C端序列、N端序列、氨基酸组成、异质组成、X-射线衍射分析（XRD）、扫描电镜分析、晶体结构学研究、红外光谱、圆二色谱、差示扫描量热分析、等电点、肽图等指标）；理化性能指标检测（如鉴别、pH、蛋白含量、纯度、分子量等指标）；污染物残留指标检测（如外源性DNA残留、宿主细胞蛋白残留、糖类残留、抗生素残留、诱导剂残留、重金属总量及微量元素残留等指标）；生物性能指标检测（如微生物限度/无菌、内毒素残留、热原等指标）。基于胶原蛋白材料应用风险评估，提供研究性资料或验证报告。
3.2半成品要求
可由一批或多批原液合并生产半成品。拟混合的每批原液应在有效期内，应按规定的工艺生产、单独检验，并符合相应的质量标准；混合的各批原液应可有效追溯；应对混合工艺进行验证。
如需对半成品进行稀释或加入其他辅料，如防腐剂或赋型剂甘油、甘露醇及缓冲盐等，应确定半成品的质量控制要求，包括检定项目和可接受标准。检定项目可包括蛋白含量、pH等指标。