北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心
随着益生菌与婴幼儿健康关系研究的不断深入，婴幼儿配方乳粉中添加活性益生菌成为一种趋势。段文锋等调研发现，市场常见的添加益生菌的婴幼儿配方乳粉中，50%以上的产品使用了双歧杆菌，添加最多的是动物双歧杆菌Bb-12，其次还有动物双歧杆菌乳亚种HN019、Bi-07和嗜酸乳杆菌NCFM。双歧杆菌作为一种重要的益生菌，是一种专性厌氧的革兰氏阳性菌，至今已有大量研究表明双歧杆菌能够调节婴幼儿肠道的菌群平衡，改善婴幼儿的免疫系统，有效促进婴幼儿正常生长发育。由于婴幼儿是特殊的敏感群体，为了规范菌株使用，2011年原卫生部发布了《可用于婴幼儿食品的菌种名单》，明确列出婴幼儿食品中可使用的菌种名称及菌株号，截至目前，经国家卫健委批准可应用于婴幼儿食品的益生菌共13株11个菌种，主要以双歧杆菌和乳杆菌为主。
婴幼儿配方乳粉中添加益生菌种类的规定保证了其安全性，而益生菌产品的活菌数是保证其功能特性的关键因素，婴幼儿配方乳粉系列食品安全国家标准均对保质期内产品中益生菌的活菌数目进行了规定，规定产品中活菌数应不小于106CFU/g（mL）。针对双歧杆菌定量检测的现行有效国家标准采用的是平板计数法，该方法在实际应用中存在耗时长（一般为72h）、工作量大和操作较繁琐等缺陷。近年来，以实时聚合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction，real-timePCR）为代表的分子生物学技术也逐渐被广泛应用到益生菌的定量检测工作中。相比较于传统培养法，real-timePCR快速、灵敏、特异，但该方法属于相对定量，结果的准确性和重复性在很大程度上依赖于所绘制的标准曲线质量及扩增效率，并且需要具备已知浓度的核酸标准品。
新兴的微滴式数字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）被认为是第3代核酸扩增技术，通过把稀释到一定浓度的DNA分子分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中DNA分子的数量为1或0，然后通过PCR扩增和阳性信号的累积读取阳性反应单元数，采集阳性信号与阴性信号的比例，再根据泊松分布计算出样本中的DNA分子数，从而实现对DNA分子的绝对定量。目前该技术在食品领域的应用日益增多，主要应用于食源性致病菌检测、转基因植物检测、动物源性成分检测等方面。国内鲜见ddPCR技术应用于婴幼儿配方食品中双歧杆菌检测的文献报道，针对现有检测方法的不足，本研究拟采用ddPCR检测技术建立针对婴幼儿配方食品中常见益生菌的快速准确定量方法，旨在为婴幼儿配方食品中益生菌的定量检测提供新的思路，为监管部门对益生菌婴幼儿配方乳粉实现有效监管提供有力的技术支撑。
Q×200ddPCR仪美国伯乐公司；PCR仪美国ABI公司；高速离心机（转速≥12000r/min）、加热混匀仪德国Eppendorf公司；BILON-08无菌匀质器上海比朗仪器有限公司；Incucell型恒温恒湿培养箱德国MMM公司；1300SeriesA2型生物安全柜美国Thermo公司。
采用改良后的细菌基因组DNA提取试剂盒，将活化后第3代的菌株培养物原液1mL放置离心机内12000r/min离心5min；倒掉上清液，加入溶菌酶200μL，37℃消化1.5h；加入蛋白酶K50μL，细菌基因组DNA提取试剂盒中提供的缓冲液GA150μL，56℃消化1.5h。后续用细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。
参考文献，对婴幼儿配方乳粉中双歧杆菌基因组DNA的提取方法进行优化：将婴幼儿配方乳粉以质量比1∶10溶于0.85%生理盐水中，取1mL乳液样品12000r/min离心10min；去掉上清液及脂肪，加入1mLPBS溶液12000r/min离心5min；-20℃冰箱放置1.5min，100℃加热混匀仪放置1.5min，反复处置样品6次；加入200μLPBS溶液，100μL蛋白酶K以及1μLTritonX-100，56℃消化1.5h；12000r/min离心5min去掉上清液，加入200μL溶菌酶37℃消化1.5h；加入蛋白酶K50μL，细菌基因组DNA提取试剂盒中提供的缓冲液GA150μL，56℃消化1.5h。后续用细菌基因组DNA提取试剂盒进行核酸提取。
配制ddPCR体系，体系为2×探针法ddPCR预混液10μL，将引物稀释到10μmol/L，取2.25μL上下游引物和1.0μL探针加入体系，加入2μL的模板，最后用灭菌双蒸水补足20μL。
将充分混匀的ddPCR体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入70μL微滴发生专用油，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应。随后将生成的40μL微滴液转移到ddPCR的96孔板中，用封膜仪对96孔板封膜，准备进行ddPCR。
ddPCR程序：95℃预变性10min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，进行43个循环；98℃固化微滴10min。
ddPCR结束后将96孔板放入QX200DropletReader仪器中，依次录入样品信息，根据Quantasoft软件计算出最终结果（copies/20μL）。
查阅文献[23]筛选出的双歧杆菌单拷贝特异基因rpsL，在基因上设计引物探针序列，利用PrimerPremier6.0设计引物探针，并通过Oligo7.37进行验证，再进行BLAST在线比对后，设计出一对引物探针，如表1所示，探针5′端标记FAM，3′端标记BHQ。对7株双歧杆菌及10株近源乳酸菌按照1.3.1.1节方法进行DNA提取，并对引物探针应用ddPCR检测方法对双歧杆菌同源及近源菌种进行检测，验证引物探针的特异性。
表1ddPCR引物和探针序列
设置3组待优化的上下游引物及探针浓度，如表2所示，以动物双歧杆菌乳亚种HN019的DNA为模板，使用上述筛选得出的一对引物探针对3组浓度分别参照1.3.2节进行ddPCR检测，根据微滴检测仪生成的结果，筛选出最优的引物探针ddPCR浓度。
表23组引物探针浓度
在设计ddPCR扩增的反应程序时，以动物双歧杆菌乳亚种HN019的DNA为模板，使用上述筛选得出的一对引物探针和相应浓度，以1.3.2节的ddPCR体系为基础，对ddPCR退火温度进行优化。设置退火温度为53、53.5、54、55、56、58℃梯度ddPCR，根据微滴检测仪生成的结果筛选出最佳退火反应温度。
对动物双歧杆菌乳亚种HN019培养物原液选取合适稀释度进行平板计数，依据GB4789.34—2016《食品微生物学检验双歧杆菌检验》方法，每个稀释度做2个平皿，置于37℃厌氧培养48～72h，观察菌落生长情况。选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，每个稀释度菌落数应取2个平板计数结果的平均值。
将37℃厌氧培养48h的动物双歧杆菌乳亚种HN019培养物原液至10-7稀释菌液，应用1.3.2.1节方法提取DNA，应用已建立的ddPCR检测方法进行检测，每个浓度梯度检测重复3次，借助SPSS14.0进行统计学分析，计算变异系数（coefficientofvariation，CV）。灵敏度根据拷贝数定量出的菌液浓度，同时与平板计数方法测定结果比较，确定定量范围，并得到检测限。
ddPCR可直接测得每反应的目标基因拷贝数（copies/20μL），ddPCR的拷贝数与对应菌悬液浓度的换算关系公式如下：
式中：C为根据ddPCR拷贝数换算得到菌悬液的浓度/（CFU/mL）；X为ddPCR中20μL体系的拷贝数/（copies/20μL）；V1为DNA提取最终的定容体积/μL；V2为DNA提取的菌悬液体积/mL；V3为ddPCR反应体系中DNA模板体积/μL。
称取未添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉5g，置于装有44mL生理盐水的均质袋内，将37℃厌氧培养48h的双歧杆菌HN019菌悬液10-1～10-5稀释度菌液各1mL，至于均质袋中，用拍击式匀浆器拍击2min，制成质量比为1∶10的样品匀液，各添加水平分别设3个样品重复，另取1份无菌称样5g婴儿乳粉样品加入45mL生理盐水，代替添加菌液作为阴性对照品，将以上5个浓度添加水平的婴儿配方乳粉样品溶液，分别梯度稀释进行平板计数方法检测。同时取各样品溶液各1mL用1.3.1.2节方法提取DNA，最终将核酸溶解在100μLTE缓冲液中，并进行ddPCR检测。ddPCR对样品的检测结果对应的菌液浓度可由1.3.5.2节公式换算得到，将其定量结果与平板计数定量结果进行比较。
对市售10份不同厂家的添加双歧杆菌的婴幼儿配方乳粉样品，应用1.3.1.2节方法提取基因组DNA并进行ddPCR定量检测，每个样品取2个平行样品，每个平行样品做3次重复，同时对样品应用平板计数方法定量检测，比较2种方法的定量结果的一致性。
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