基于发夹探针激活CRISPR

本发明涉及一种基于发夹探针激活crispr-cas12a系统的方法及其应用，属于基因检测及分子诊断领域。

背景技术：

1、microrna(mirna)是一种由18-24个核苷酸组成的短链非编码rna，在多种癌症的发生发展中发挥着重要的作用。大量研究发现在癌症中mirna普遍异常表达或特定类型的mirna异常表达，以及参与癌症对各种治疗耐药性的形成；且证明了mirna在癌症诊断、药物疗效监测及预后评估中作为生物标志物的潜力，因此，快速、灵敏、准确检测mirna具有重要的临床价值。目前，mirna定量检测方法主要采用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术，但由于mirna序列短，通常采用茎环法或者加尾法对其进行逆转录获得cdna之后，再结合荧光定量pcr对其进行检测，所以该方法存在引物设计困难、操作步骤繁琐和耗时长等缺点。近年来，多种等温核酸扩增技术被引入mirna检测方法的开发，虽在一定程度上满足了短链mirna检测的需求，但这些方法在准确性上难以与传统rt-pcr技术相媲美，因此，未能发展为临床适用的mirna检测方法。

2、crispr系统已成为基因编辑、转录调控和分子诊断的强大工具。其中，crispr-cas12a系统是最具影响力和最有前途的crispr-cas系统之一。crispr-cas12a系统可对剪切靶点上游含特定tttn序列(pam序列)的双链dna(dsdna)进行识别和顺式剪切活性，同时启动高效的反式剪切活性，即无差别剪切单链dna(ssdna)。dsdna激活crispr-cas12a系统的顺式/反式剪切活性机制如下：首先，cas12a蛋白的氨基酸残基通过氢键和范德华力与dsdna的pam序列相结合。随后，cas12a蛋白的解旋酶活性被激活，导致dsdna不稳定并解旋，然后crrna的可编程间隔序列与不稳定的dsdna上靶标链(ts)杂交，进而激活crispr-cas12a系统的顺式/反式剪切活性。由于传统的dsdna激活模式需要pam序列，因此，极大限制了crispr-cas12a系统应用的通用性。

3、综上，亟待发展一种无pam限制激活crispr-cas12a系统的模式，并应用于构建快速、灵敏、准确检测mirna的方法。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于发夹探针激活crispr-cas12a系统的方法，利用靶mirna与发夹探针一步杂交链置换反应即可高效激活crispr-cas12a系统，由此实现免pam序列识别的直接、快速、灵敏检测mirna。

2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于发夹探针激活crispr-cas12a系统的方法，包括以下步骤：制备发夹探针；将crrna和cas12a蛋白混合后，加入反应缓冲液、发夹探针、f-q探针、核糖核酸酶抑制剂混匀，最后加入靶mirna，孵育后终止酶反应；所述发夹探针的环部区域为mirna的识别域，茎部区域为crrna的结合域，所述发夹探针中无pam序列；当靶mirna与所述发夹探针的环部区域杂交后，引发crrna与发夹探针的茎部区域相结合，从而激活crispr-cas12a系统的顺式和反式剪切活性。

3、优选地，所述发夹探针通过95℃，5min退火制备得到。孵育后终止酶反应具体为：在37℃下孵育45min，然后在65℃下孵育10min终止酶反应。

4、本发明还提供了一种mir-21检测试剂盒，包含crrna、cas12a蛋白、反应缓冲液、发夹探针以及f-q探针，所述发夹探针的环部含有与靶标mirna特异性识别的核苷酸序列，所述发夹探针的茎部含有与crrna特异性结合的核苷酸序列；所述发夹探针中不含有pam序列。

5、优选地，所述发夹探针和crrna浓度均为25nm，所述f-q探针浓度为500nm，所述反应缓冲液为nebuffer3。

6、优选地，所述发夹探针的核苷酸序列如seqidno.2至seqidno.10任意一项所示。

7、优选地，所述crrna序列如seqidno.1所示。

8、优选地，所述f-q探针为修饰有fam荧光基团和bhq1猝灭基团的ssdna，序列为fam-ttatt-bhq1，被激活的crispr-cas12a系统反式剪切后，荧光信号恢复。

9、本发明通过设计发夹探针作为crispr-cas12a系统的触发底物，实现了无pam序列激活crispr-cas12a系统的顺式剪切和反式剪切活性，同时无需繁琐逆转录等前处理步骤，实现一步反应对mirna的快速、灵敏检测。本发明利用免pam序列识别的发夹探针激活crispr-cas12a系统，并扩展到mirna检测的应用，具有设计简单、一步操作即可完成mirna检测的优点。

1.基于发夹探针激活crispr-cas12a系统的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述发夹探针通过95℃，5-10min退火制备得到。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于，孵育后终止酶反应具体为：在37℃下孵育45min，然后在65℃下孵育10min终止酶反应。

4.一种mir-21检测试剂盒，其特征在于：包含crrna、cas12a蛋白、反应缓冲液、发夹探针以及f-q探针，所述发夹探针的环部含有与靶标mirna特异性识别的核苷酸序列，所述发夹探针的茎部含有与crrna特异性结合的核苷酸序列；所述发夹探针中不含有pam序列。

5.根据权利要求4所述mir-21检测试剂盒，其特征在于：所述发夹探针和crrna浓度均为25nm，所述f-q探针浓度为500nm。

6.根据权利要求4所述mir-21检测试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为nebuffer3。

7.根据权利要求4所述mir-21检测试剂盒，其特征在于：所述发夹探针的核苷酸序列如seqidno.2至seqidno.10任意一项所示。

8.根据权利要求4所述mir-21检测试剂盒，其特征在于：所述crrna序列如seqidno.1所示。

9.根据权利要求4所述mir-21检测试剂盒，其特征在于：所述f-q探针为修饰有荧光基团和淬灭基团的单链dna。

10.如权利要求1-3任意一项所述基于发夹探针激活crispr-cas12a系统的方法，在生化电路、dna反应网络中对生物分子检测的应用，所述应用为非疾病与诊断上的应用。