新型冠状病毒疫情爆发以后，早期诊断成为控制疫情的关键，而荧光PCR技术成为首选的初筛检测手段。到目前为止已经有数家企业获得了新型冠状病毒荧光PCR检测试剂的临床注册批文，还有近百家企业开发了类似的产品。近期有诸多声音反映现有的新型冠状病毒荧光PCR检测试剂盒灵敏度较低，目前检出率只有30-40%，多次出现漏检的情况。业界对此进行了广泛的讨论，一个共识是造成检出率低，假阴性率高有很多原因，包括试剂盒的灵敏度、试剂盒原材料的质量、核酸提取的效率、仪器设备的质量、操作误差等，但是对试剂盒的灵敏度低的原因没有系统的分析。笔者认为，引物探针设计是决定试剂灵敏度的关键，设计上存在的问题是内在缺陷，很难通过优化试剂盒组分和调整实验条件来得到显著改善。
任何技术都有优缺点，站在不同的角度，侧重点不一样，或者使用的参数或算法或软件不一样，结论也可能各有所异。理论分析毕竟与临床样本检验的结果不可同日而语。产品的灵敏度最终都得经过临床试验，达到注册检验要求为标准。文中观点难免偏颇，欢迎批评指正。
二、Taqman探针法荧光PCR的基本原理
实时荧光PCR是一种实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术。Taqman探针法是实时荧光PCR中应用最广泛的技术。它的基本原理是在反应中加入一对特异的引物及一条经荧光标记的Taqman探针，探针的5’端用报告荧光基团标记，3’端用淬灭荧光基团标记。在探针完整时，由于荧光共振能量转移（FRET）的作用，报告基团的荧光被淬灭基团吸收发出不同于仪器收集波长的荧光，不能检测到扩增信号，因此探针必须依赖Taq酶的5’-3’的外切活性，在引物结合到模板后随着合成双链的进程，将已经与模板结合成双链的探针切割，使报告荧光基团脱离淬灭基团的屏蔽而发出仪器应检测的荧光信号。常用的报告基团包括HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等，淬灭基团包括TAMRA、BHQ等。
三、Taqman探针法荧光PCR引物探针的设计
一些最基本的原则可以参考美国ABI（赛默飞）的PrimerExpress3.0指南（表1）。
表1：Taqman荧光PCR探针和引物设计指南（PrimerExpress3.0,ABI）
根据我们的经验，最重要的参数包括引物探针的位置、Tm值、发夹结构、二聚体。以下以WHO发表的美国CDC的N基因引物探针（表2）为例加以详细论述。
表2：美国CDC设计的引物探针序列
1、引物探针的位置
引物探针的设计原则中，最重要的是要避免假阴性（漏检），同时保证特异性（避免假阳性），所以要选择组内（需要检出的序列）保守（即尽量避开突变或采用简并序列）、组间（对照序列）特异的区域。此外，为了获得最佳的扩增效果，还应尽量满足表1中的基本要求。
用SARS和蝙蝠CoV的N基因序列作为对照，对新型冠状病毒的N基因序列排序，从图1、2、3中可见，在美国CDC的设计中，除了第二套的上游引物不特异外，其余探针和引物的位置都是选择了组内保守组间特异的区域。第二套的探针和下游引物都是在特异的区域，所以也不会产生非特异的扩增。
图1：美国CDC2019-nCoV第一套引物探针位置
图2：美国CDC2019-nCoV第二套引物探针位置
图3：美国CDC2019-nCoV第三套引物探针位置
第三套设计的探针N3P对2019-nCoV不特异（可同时结合到蝙蝠CoV）,5’端第二个位置设置为Y即T/C简并，恰恰不能区分新型冠状病毒、蝙蝠冠状病毒和SARS病毒。但是上下游引物均为2019-nCoV特异，可能不会产生非特异性（假阳性）扩增。
2、Tm值
Taqman探针法荧光PCR通常采用二步法，即在94℃左右变性，60℃退火和延伸。所以，通常引物的Tm值设计在60±2℃，探针在70±2℃。
图4:美国第一套设计的Tm值
图5：USCDCN基因第二套Tm值
图6a:USCDCN基因第三套Tm值，探针5’端第二个序列为C
图6b:USCDCN基因第三套Tm值，探针5’端第二个序列为T
从图4、5、6中可见，这三套设计中的Tm值基本符合表1中的要求。第三套的探针N3P5’端第二个序列设计为Y（T/C简并），此处为C时（图6a），探针N3P的Tm值略高，但通过优化应该不会成为主要问题。
3、引物和探针的发夹结构
稳定的二级结构（二聚体或发夹）降低引物探针利用效率的重要因素，特别是探针的发夹，容易造成探针利用率降低，从而使荧光信号偏低，影响检测灵敏度。通常应控制发夹的dG≥-1.0(注：dG是一个用于衡量裂解二聚体或发夹所需要能量的参数，二级结构越稳定，裂解所需的能量越多，dG越小)。
采用DNAStar软件对美国CDC设计的三套引物探针的发夹结构进行分析，结果（图7）发现，第一套的下游引物N1R具有一个稳定的发夹结构（dG=-2.3kc/m），第三套的探针N3P具有一个稍微稳定的发夹结构（dG=-1.3kc/m），其余引物和探针均没有稳定的发夹。
图7：USCDC引物和探针的发夹结构
4、二聚体
设计时通常将二聚体（自身二聚体或配对二聚体）控制在dG>-5.0kc/m,最好dG>-3.6kc/m。从图8显示的三套引物探针的自身二聚体可见，第二套的探针具有一个非常稳定的自身二聚体（dG=-13.1kc/m），第二套的上游引物N2F有一个稳定的自身二聚体（dG=-9.3kc/m），第三套下游引物具有一个比较稳定的自身二聚体（dG=-7.0kc/m）。
图9显示，美国CDC的第二套引物探针具有比较稳定的配对二聚体（dG=-9.0kc/m）。图10显示第三套有两个比较稳定的配对二聚体（dG=-10.1kc/m）。
图8：美国CDC基因引物和探针的自身二聚体
图9：美国CDC第二套引物探针的配对二聚体
图10：USCDC第三套引物探针配对二聚体
此外，当采用一管多检（多重PCR）时，即一管同时检测多个位点或多种病菌时，还要考虑不同位点之间的引物探针的配对二聚体。例如第一套和第二套组合时（图11），第一套的正向引物和第二套的探针有一个相对稳定的配对二聚体（dG=-8.3kc/m）。第一套和第三套组合时（图12），第一套的探针和第三套的正向引物有一个稳定的二聚体（dG=-12.2kc/m）。第二套和第三套组合时，第二套的上游引物和第三套的上、下游引物各有一个比较稳定的二聚体（dG=-7.0kc/m图13）。
图11：美国CDCN基因第一套和第二套配对二聚体
图12：美国CDCN基因第一套和第三套配对二聚体
图13：美国CDCN基因第二套和第三套配对二聚体
综上所述，美国CDC设计的三套引物探针，位置的选择及Tm值的设计均比较合理，但是二级结构比较稳定。第一套的反向引物N1R存在一个非常稳定的发夹（dG=-2.3kc/m，图7）。第二套探针的自身二聚体非常稳定（dG=-13.1kc/m，图8），上游引物自身二聚体也比较稳定（dG=-9.3kc/m，，图8），比较稳定的配对二聚体比较多（dG=-6.8～9.0kc/m,图9），引物和探针的利用效率会比较低。第三套探针N3P具有一个相对稳定的发夹（dG=-1.3kc/m，图7），探针和引物值均有相对稳定的配对二聚体（图10）。
四、结果的判断
美国CDC提出对结果的判断意见，认为只有当三个位点同时扩增曲线超过域值才能判断为阳性（如图11）。
笔者认为这种判别是没有理论依据的。Taqman探针法荧光PCR除一对特异的引物以外还有一条特异的探针，基于设计的非特异性扩增的理论概率是非常小的。在新型冠状病毒检测中，以美国CDC的第一套引物探针为例，从图1可见，上游引物处SARS病毒有一个3-bp的插入，是不可能扩增的，蝙蝠病毒在上游引物有4个突变，探针有1个突变，下游引物有5个突变，理论上由于错配检测出最接近的蝙蝠序列（假阳性）的概率为(1/4)10=9.5367x10-7。如果出现假阳性，最大可能性是交叉污染或气溶胶污染。正确的判断应该是，上述三个位点至少一个位点的扩增曲线超过了域值，即可判断病例为阳性。目前市场上常见的荧光PCR检测试剂大多数也只使用一个位点。
五、结论和建议
引物探针的设计原则中，最重要的是要避免假阴性（漏检），同时保证特异性（避免假阳性），所以要选择组内（需要检出的序列）保守（即尽量避开突变或采用简并序列）、组间（对照序列）特异的区域，同时尽可能提高反应中引物和探针的利用效率。笔者认为参数的重要性依次是引物探针的位置、探针的发夹结构、探针对上游引物的相对位置、Tm值、引物发夹、二聚体。
笔者对WHO发表的来自七个国家设计的引物探针进行了详细分析，发现均存在一定的缺陷，有些缺陷比较明显，主要体现在：
1）不特异（德国的E基因、香港大学Orf1b基因）；
2）探针的发夹结构稳定（中国CDCOrf1ab基因的探针、德国的SARSRdRP基因探针P1、香港大学N基因的探针）；
3）引物和探针的相对位置不合理（中国CDC的N基因、德国的E基因、香港大学的Orf1b基因及E基因（设计在反链上）、日本的N基因）；
4）Tm值不合理（中国CDC的N基因及Orf1ab基因、德国的SARSRdRP基因及E基因、香港大学的Orf1b基因及N基因、日本的N基因、泰国的N基因）；
5）引物的发夹结构稳定（美国CDCN基因第一套的反向引物、香港大学Orf1b基因的正向及反向引物、香港大学N基因的正向引物）；
6）引物探针的自身二聚体稳定（中国CDCOrf1ab基因反向引物、美国CDC的N基因第二套的探针N2P、德国的E基因探针P1、香港大学的N基因正向引物及探针）；
7）引物探针的配对二聚体稳定（中国CDC的N基因、美国N基因第二和第三套、德国的E基因）。
笔者认为存在稳定的发夹结构的探针基本不可以用。探针离上游引物太远的扩增效率低，很难通过优化来提高效率，应该尽可能避免。其他二级结构可能通过添加PCR促进剂或加入过量的组分（引物探针、Taq酶等）得到改善，Tm值不理想可以通过调整退火和延伸的温度，但是象以上一些设计的引物和探针Tm值几乎一样，是不合理的，应该避免。
实际上，新型冠状病毒的基因组与最接近的蝙蝠冠状病毒的差异达到4%，与SARS病毒的差异达到20%，而目前的数据显示武汉新型冠状病毒内部的差异非常小，约为十万分之三（3.3x10-5），在基因组中或在N基因及Orf1ab基因中均有很多区域可以设计特异的、高效率的引物探针用于荧光PCR检测试剂的开发应用。
磨刀不误砍柴工，在科学技术面前没有真正的捷径可走。科学地设计引物探针是开发荧光PCR检测试剂的基础，是保证试剂盒灵敏度及特异性最基本的要素。为了避免走弯路，浪费资源，建议行业内的厂家，严格按照荧光PCR技术引物探针设计的原则开发新型冠状病毒荧光PCR检测试剂。
作者简介：林镜中，加拿大多伦多大学博士，美国加州大学博士后。深圳市海外高层次B类人才。现任深圳市赛格诺生物科技有限公司首席科学家/总经理。曾任深圳市太太基因工程有限公司创始人/总经理，美国Lynx医药公司高级研究员。