一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打
开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，rna抽提
需带口罩。③取ep管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完ep管/枪头
后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，
移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤
实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。二、总rna抽提
1）细胞培养皿中细胞样品用1*pbs洗两次后，用1ml枪将pbs吸干净，加入1mltrizol
（invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5mlrnasefreeep管中使细胞充分裂解，室温
静置5min；
组织样品用液氮充分研磨，加入1mltrizol（invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min
使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，
使水相和有机相充分接触，室温
静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与
第一步的顺序一致）
3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，rna在上层水相，移至另一个新的rnase
freeep管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头
不可碰到、吸到中间层）4）沉淀rna：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8应
用振荡器混匀），室温静置10min；
5）4℃下，14,000g离心10min，收集rna底部有沉淀，应将ep管放置在-80度冰箱过
夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集rna沉淀），去上清；
6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min倒ep管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打
沉淀），超净台风干；沉淀不
能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。7）视沉淀量加入适量depc水（至
少15ul）溶解沉淀。三、去基因组
使用rnase-free的dnase（promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃
灭活10min。
rnadnase10xbufferh2o(rnasefree)rnasin总
体积
然后按以下步骤操作：
1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，
离心15min，取上清。
2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，
取上清。
3）加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15min；4）4℃下，
14,000g离心15min，收集rna沉淀，去上清；5）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），
超净台风干；6）加入适量depc水（至少15ul）溶解沉淀。
四、总rna纯度和完整性检测
1）纯度检测：取1μlrna样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定od值，od260/od280