关键词：IPTV网络；P2P；技术开发；CDN
作者简介：宋利(1976-)，女，湖北蒲圻人，硕士，中国电信武汉分公司增值业务部维护服务室通信工程师，研究方向为管理信息化。
0引言
IPTV（InternetProtocolTelevision，互联网协议电视）系利用宽带，以电视、电脑为主要终端电器，在IP网络上传送包含电视、视频、图形和数据等，并提供服务质量/服务感受(QoS/QoE)保证、安全、交互性和可靠性的可管理的多媒体业务。P2P技术因为Skype以及BT文件传输等应用而为一般网络用户所熟悉。近年来，如何利用P2P提供网络互动电视之P2PIPTV系统已成为IPTV应用技术发展的一个新研究方向。因此，本文针对P2PIPTV技术发展中存在的问题进行研究。
目前的IPTV系统多采用C/S模式提供单播和点播业务（包括VoD和时移电视），由于服务器输出/输入(I/O)瓶颈的限制，一台服务器只能够支持有限的并发流。如果用户较多或者服务器与用户距离较远发生阻塞时，用户观看节目效果就会降低。为减轻中小服务器的负担、提供用户访问内容的响应速度，当前比较主流的IPTV网络一是采用组播来提供广播，二是在媒体分发时大多采用内容分发网络（CDN）技术，通过在现有的Internet中增加一层新的CDN网络架构，将内容到离用户最近的网络“边缘”，使用户可以就近取到所需要的内容，提高用户访问网站的响应速度。
当用户要观看节目时，首先需要确定最接近用户的最佳CDN服务器，即上面的边缘服务器，同时将用户的请求指向该节点。CDN可以明显提高Internet网络中信息流动的效率，从技术上解决由于网络带宽小、用户访问量大、网点分布不均等问题，提高用户访问网站的响应速度。当用户的请求到达指定节点时，CDN的服务器（边缘服务器）负责将用户请求的内容提供给用户。通过用户定位算法和服务器健康检测算法综合后的数据，可以将用户的请求就近定向到分布在网络边缘的服务器上，保证用户的访问能得到更及时可靠的响应。
1规模与成本问题
现有的网络要支持组播就需要进行改造，这会直接导致运营成本的增加。CDN架构可将IPTV头端对外的带宽分散到各个区域，能够缓解因为服务的用户数不断增长而给中心服务器带来的性能和带宽压力。但是当请求的用户数持续增长时，边缘服务器仍然会面临着性能瓶颈，不仅需要部署更多的流媒体服务器还有极大的网络带宽，随着用户规模的增长会带来实际运营成本的持续增涨。
P2P最大的特点是随着规模的增长而成本直线下降。当今互联网，P2P技术通过著名的长尾效应，在提高用户的下载或浏览速度的同时又降低了对内容服务器的依赖。P2P方式下，每个对等实体（Peer）既是服务的享用者，又是服务的提供者。以BT下载文件为例，下载同一个文件的众多用户，每一个用户终端都只需要下载文件的一个片段，然后互相交换，最终用户都可以得到所有片段以组合成一个完整的文件。该P2P架构的优点在于用户数增加时并不会同时增加服务器端的负载，还可以规避单点故障的无难题，极大提高了系统的扩展性。
但是P2P技术往往会无节制吞噬网络带宽，这是P2P技术最大的劣势。P2P技术采用的资源定位算法路由效率较低，如泛洪算法，给网络带来巨大的查询流量；同时P2P技术在选择提供服务的服务端对等点时仍缺乏有效的管理和引导，基本处于自由放任状态，导致大量不合理的P2P流量，同时吞噬了大量的网络带宽资源。
由于P2P应用开发商作为网络的使用者，他并不关心网络的运维成本，而只是想着如何充分利用网络资源，所以，非常多的P2P应用在改进P2P对网络带宽的吞噬上进展不大。而网络运营商则由于P2P大量应用而导致无法从持续网络扩容中获得经济利益，因此，网络运营商对P2P技术采取的是反对的态度，2002年，以AT&T及Comcast为代表的部分美国网络运营商公开表示要对P2P应用进行限速和拦截。
2IPTV网络中CND和P2P技术结合点分析
自从2007年起，国外CDN服务商和电信运营商已经开始利用P2P技术降低CDN部署的高昂成本：Internap和P2P服务商PandoNetworks共同了带有P2P接入的InternapCDN平台；Velocix将P2P技术与传统CDN技术结合创建一个混合CDN或对等辅助CDN；目前中国国内有10多家网站采用自主开发的软件提供P2PInternet流媒体直播视频服务。用户最多的是PPLive网采用的Synacast系统。由于采用了P2P技术进行流媒体分发，1台100Mb/s接入互联网的普通PC服务器可以同时提供5~10路视频节目的直播，每一路节目均可以支持百万用户同时收视，播放的电视节目码率一般为3~500kb/s的码率，有些频道已经开始提供800kb/s的码率，超过VCD的画面质量。
目前在CDN中引入P2P技术是IPTV领域的一个研究热点，有在边缘服务器层面引入P2P技术，也有在终端层面引入P2P技术，还有同时在边缘服务器和终端层面同时引入P2P技术。由于CDN网络是一种分域的网络，特定域内的边缘服务器数量并不太多，如果仅在边缘服务器直接实现P2P并不能充分发挥长尾效应。因此，要彻底改变当用户激增时网络服务器瓶颈就必须在终端层面引入P2P技术。
综合考虑终端的成本和能力，以及终端在线的随意性，边缘服务器还必须作为备选对等服务点，从而提高用户资源定位的成功率，避免大量的P2P查询流量。由于网络运营商与内容运营商在P2P技术的使用上存在态度上的差异的。P4P技术在解决P2P流量方面给我们提供了许多可以借鉴的经验。网络运营商应采用积极态度，参与到P2P数据的交换中来，积极疏导P2P垃圾查询流量，对用户的资源请求进行有效的管理和引导，从而实现对P2P流量的优化。
IPTV的发展面临客户机/服务器模式的制约，在IPTV网络中引入P2P技术是近年来IPTV技术发展的趋势，如何在引入IPTV技术同时避免P2P技术自身缺陷（如流量问题、安全问题等等）是在CDN网络中引入P2P技术的难点。面对日益增长的网络点播用户，如何维护IPTV网络的可管理性和安全性，同时充分利用现有资源、降低运营成本，同时又带给网络用户良好的体验，在以CDN结构为基础的流媒体分发网络中融合P2P技术不失为一种有意义的尝试和探索。
参考文献：
[1]卢官明,宗.IPTV技术及应用[M].北京:人民邮电出版社,2007.
[2]杨天路,刘宇宏,张文.P2P网络技术原理与系统开发案例[M].北京:人民邮电出版社,2007.
[3]杨传栋,余镇危,王行刚.结合CDN与P2P技术的混合流媒体系统研究[J].计算机应用,2005(9).
[4]邓亮.P2P与CDN结合实现的IPTV点播业务[J].网络应用,2007(1).
TheTechnicalAnalysisforCombiningCND
andP2PinIPTVNetwork
结合PowerPoint软件中的母版技术特别是2007／2010版提供的主题功能，能够实现PPT课件界面的自主灵活设计。
在PowerPoint中的模板、配色方案、母版为界面设计提供了统一设置的工具，点位符及各种调整工具、形状填充等工具可以对界面中的各种元素进行灵活修改。特别是PowerPoint2007／2010提供了主题功能，将母版，字体，色彩等集成进行统一设计，不仅实现了界面设计与内容的相对独立，也提高了界面设计的效率。另外PowerPoint中的SmadArt、图像及文字的快速样式设置也丰富了界面元素的美化方式，增强了PPT课件界面设计能力。
配色方案是PowerPoint中设置及管理色彩的工具，编辑预置的颜色可以统一修改所有对象的颜色效果，PPT课件界面设计可以用配色方案设置超级链接，文本框前景、背景等各种对象的颜色。
PowerPoint中的主题是对幻灯片中对象的格式预置，包括主题颜色、字体、样式等，通过对主题的修改，可以将编辑的效果应用于图表、SmartArt图形、形状、图片、表格、艺术字和文本。使用主题效果库，可以替换不同的效果集以快速更改这些对象的外观。
模板是PPT课件界面设计中最常用但也最容易出问题的工具，模板是根据幻灯片的结构设计的一系列幻灯片效果。近年来PPF模板设计有了很大的发展，内容更为丰富，一般包括：片头动画、封面、目录、过渡页、内页、封底、片尾动画等页面。
母版是相应版式的幻灯片模型，PowerPoint2003中母版版式有两种：标题母版和幻灯片母版，在PowerPoint2007／2010中每一种版式的幻灯片都有相应的母版，设置更为灵活，通过母版可以统一修改某一类(版式)幻灯片的布局和外观，PowerPoint的多母版技术是指模板(主题中)包含多种母版版式，幻灯片可以按相应需求进行选择应用。
二、基于主题的PPT课件界面设计方法
基于主题的PPT界面设计方法有两层含义，一层是指在PPT界面设计中利用主题技术进行界面设计，而不是采用直接套用模板的方式修改PPT的界面，主题技术包括：自定义主题设置、自定义主题保存、主题利用等(PPT主题方法适用于PowerPoint2007／2010)。
1自定义主题设置。自定义主题设置包括PPT的色彩配置、字体设置、效果选择、背景设置等，如果需要修改幻灯片的布局与版面可以对主题的母版进行重新定义和编辑。
2自定义主题保存：在PPT中幻灯片主题可以保存为独立的主题文件，方便界面设计方案的迁移与重用。
3主题利用是指将已有的主题设计应用到新的课件作品中，在PowerPoint中通过浏览主题选择进行选择即可。
三、基于主题的PPT课件界面设计实现方法
课件制作追求内容与形式的统一，但另一方面却又希望课件具体内容与显示界面相对分离，界面与内容的分离能够大大提高界面修改的效率，并且方便课件界面的重复使用，PPT主题统一管理PPT的显示外观，集成了PPT的母版(模板)、配色方案、字体设置等，下面介绍利用主题进行PPT界面设计的方法及主要过程。
2选择一个模板幻灯片或作品，保存主题。在选择过程中应当注意自己的课件的内容，学科特点，适用对象等，让界面与课件内容相统一，最好的方法是自己在一定的基础上对母版进行重新设计，增加能表达内容主题的元素，并且经过一定的积累形成自己学科课件的界面风格。
3将自己保存的主题应用到课件内容幻灯片上。
4在课件内容幻灯上选择幻灯片的版式，统一修改字体和颜色以及其他对象的效果。
5对于无法应用版式的幻灯片可以采用重用幻灯片的方式导入模板或作品中的幻灯片，或在母版设计中添加新的母版样式，重用幻灯是指在PPT插入幻灯片中选择，不是复制与粘贴幻灯片。
[关键词]ASP.NET数据库动态SQL
最近,一些基于TCP或IP的Internet或Intranet技术,被广泛应用于各级企业网站,其中一个很重要的手段就是建立Web站点和浏览信息。传统的静态网页技术已越来越不能满足用户的需求,因此各种动态网页技术应运而生。ASP就是目前比较流行的动态网页技术之一,而ASP.NET是微软的新一代动态网页技术。ASP.NET不是ASP的简单升级,而是微软公司推出的新一代ActiveServerPages,是微软公司推出的新一代体系结构Microsoft.NET的一部分。Microsoft.NET主要由Windows.NET、.NETFramework、.NETEnterpriseServer、Orchestration、MSN.NET、OFFICE.NET、VisualStudio.NET、bCentral.NET等部分组成。其中全新的技术架构会使编程变得更简单,ASP.NET是在抓住ASP的最大优点并全力使其扩大化的基础上开发出来的,同时也修复了许多ASP运行时会发生的错误。
一、ASP.NET的技术的发展及现状
ASP.NET是建立在微软新一代.NET平台架构上,利用普通语言运行时(CommonLanguageRuntime,CLR)在服务器后端为用户提供建立强大的企业级Web应用服务的编程框架。ASP.NET可完全利用.NET架构的强大、安全和高效的平台特性,是运行在服务器后端编译后的普通语言运行时的代码,运行时早绑定(EarlyBinding)、即时编译、本地优化、缓存服务、零安装配置和基于运行时代码受管与验证的安全机制等都为ASP.NET带来了卓越的性能。对XML,SOAP,WSDL等Internet标准的强有力的支持,为ASP.NET在异构网络里提供了强大的扩展性。
二、ASP.NET的优点
1.支持多种脚本语言
ASP曾在脚本引擎方面受到限制，特别是VBScript和JavaScript。而可以支持中的多种语言,例如C#、VB.Net等。这意味着可以摆脱VBScript的语言限制,代码将是编译后运行的而不是原来的解释执行。
2.服务器处理
在Internet上作为服务的软件是WebServices的核心。ASP.NET提供了一个WebServices的基础构造环境,从而使开发人员能够为这个服务模型创建服务。WebServices的不同之处在于,它允许你暴露一个服务而不必暴露数据。当自动提供商业服务的同时,代码和数据都是安全的。
3.代码与内容的分离
通常ASP代码是和内容混合在一起的,设计和编写代码同时进行会变得困难。如果页面需要升级,就会存在危险的潜在问题。ASP.NET可通过两种方法来解决这个问题。第一种是代码内联模型,在该模型中代码仍然保存在ASP.NET页面中,但它并不和HTML混合在一起。第二种分离代码和内容的方法是代码后置模型,该模型中的代码被完全转移到一个单独的文件中。
4.更好的代码控制
对于COM对象不再需要再在服务器上注册这个功能,是非常受程序员喜爱的。但是通过这种过程简化,你再也不能够在你的服务器上运行另外一个DLL版本,并且代码相当保密。这就意味着,如果没有正确的开发工具和源代码,很难改变代码。
5.更好的升级能力
此系统建成,本身有着一定的特性,以改进多处理器环境中的性能。例如,sessionstate能够通过单独的处理器来维持,在一个单独的机器上,甚至在数据库中允许交叉的服务器会话。
三、ASP.NET的运行环境
a.服务器端:Windows2003Server。
b.客户端:InternetExplorer5.5以上。
c.ASP的开发环境:Visual2005。
d.ASP.NET的开发语言:,C#。
四、ASP.NET与WEB数据库的连接
ASP.NET不仅带来了,还带来了SQLManagedProvider。这样在里,我们就有了三种连接数据库的方式:
(1)ADO.NETManagedProvider
(2)SQLManagedProvider
(3)ADO.NETManagedProvider+ODBC
其中,方式(1)可以连接到任何ODBC或者OLEDB数据中心,而方式(2)可以连接到MSSQLServer。三种方法的对比如下:
一般来说,这三种存取数据库的方法中,SQLManagedProvider效率最高,其次是ADO.NETManagedProvider+OLEDB,最差的是ADO.NETManagedProvider+ODBC。
SQLManagedProvider要优于ManagedProvider,而从ODBC和OLEDB的对比来看,OLEDB要优于ODBC。
ASP.Net与Access数据库连接:
ASP.Net与SQL数据库连接:
建立记录集对象:
五、总结
ASP.NET从现有的ASP结构体系上跨出了一大步,其整个构造体系使开发结构化的应用程序变为可能。Web表单设计带来了一种更加直接和易于使用的开发模式。服务器控件增加了提供公共功能的能力,从而使扩展和加强现有功能变得容易。数据捆绑使创建数据约束型应用程序变得十分简单。它不但具有许多很棒的新功能,而且还有一个用于开发Web应用程序的真正框架。使用ASP.NET的组件,可以轻松地实现对网页内容的动态控制,根据不同的浏览者,生成不同的页面内容。在ADO.NET的支持下,ASP.NET与远程主机上的数据库的连接与操作变得非常简单。随着越来越多的开发者开始使用这种新技术,给Internet的发展带来了一次新的浪潮。
[1]曹建英:的安全性及其实现的策略[J].温州师范学院学报,2005,(02)
[2]兰静:基于的在线考试系统[J].山西广播电视大学学报,2005,(02)
关键词：GPS；RTK；供水管线；测量；移动站
引言
单点定位的GPS技术，可应用于地面车辆、船舶等概略定位的精度为30-100m的伪距单点定位。而实时差分定位的GPS技术，精度可以达到厘米级，则可应用于土地利用调查、土地整理、地形测量、线路测量等工程项目，可以降低作业人员工作强度、提高工作效率、节约作业成本。GPSRTK技术用于供水管线测量工程，可以最大限度地减轻勘测工作量、提高勘测效率和勘测精度，一直是水利测量工作者孜孜以求的目标。
1.GPSRTK系统的特点
1.1RTK测量的基本原理
RTK（RealTimeKinematic）即实时载波相位差分技术是基于载波相位观测值的实时动态定位技术，它是利用多台（2台以上）GPS接收机同时接收卫星信号，其中一台安置在己知点上作为基准站（也可以任意设置测站），另外的接收机用来测定未知点的坐标即流动站。在RTK作业模式下，基准站通过数据链将其载波相位观测值和测站三维坐标信息（如基准站坐标和天线高度）一起传送给流动站，流动站在完成初始化后，一方面通过数据链接收来自基准站的数据，另外自身也采集GPS观测数据，并在系统内组成差分观测值进行实时一处理，再经过坐标转换，即可给出实时的厘米级定位结果。RTK是以WGS-84系统做为基准坐标系统的，其全部观测值及解算结果均属于WGS-84系统。
GPS测得的高程是该点在WGS-84椭球上的大地高，必须采用高程拟合的方法，来求得正常高。而高程拟合的精度取决于由GPS大地高程转换为正常高的精度，其中关键是高程异常的精度，也就是说，参与拟合的水准点的个数及分布的均匀控制程度和地形起伏状况。对于引水管线放样来讲，路线两侧布设的水准点足以保证中桩高程的拟合精度。
1.2RTK测量的特点
（1）RTK作业自动化、集成化程度高，测绘功能强大，RTK可胜任各种测绘内、外业流动站无需人工干预便可自动实现多种测绘功能，使辅助测量工作减少，减少人为误差，保证了作业精度
（2）降低了作业条件要求RTK技术只要求满足“电磁波通视”和对天基本通视，因此，和传统测量相比，RTK技术受通视条件、能见度、气候、季节等因素的影响和限制较小，只要满足RTK的基本工作条件，它就能进行快速的高精度定位作业。
（3）定位精度高，数据安全可靠，没有误差积累，不同于个站仪在多次搬站后，都存在误差累积的状况，RTK没有误差积累只要满足RTK的基本工作条件，在定的作业半径范围内，RTK的平面精度和高程精度都能达到厘米级。
（4）操作简便、数据处理能力强，移动站可以边走边获得测量结果坐标数据输入、存储、处理、转换和输出能力强，能方便快捷地与计算机、其它测量仪器进行通信。
2.RTK测量技术的工作条件
（1）基准站和流动站同时接收到5颗以上GPS卫星信号。
（2）基准站和流动站同时接收到卫星信号，流动站实时接收到基准站发出的差分信号。
（3）基准站和流动站要连续接收GPS卫星信号和基准站发出的差分信号即流动站迁站过程中不能关机，不能失锁，否则RTK须重新初始化。
3.RTK外业实施过程
GPS定位是直接得到点位在WGS-84中的坐标和高程，故进行GPS-RTK测量时需要进行坐标转换或点位校正，从而求得地方坐标与WGS-84坐标间的转换参数。
RTK具有静态、稳定等功能，事先必须对其主机作相应的基准站、移动站、静态或GPRS设置。作RTK使用，若用常规UHF电台，则基站设为外挂UHF电台基站方式，移动站设为内置UHF电台移动站方式；若用GPRS通讯，则基站设为内置GPRS基站方式，移动站设为内置GPRS移动站方式。
移动站在两个己知控制点上采集数据（解类型必须为固定解），通过添加己知点坐标或在控制点坐标库中查找，求转换参数并进行高程拟合。待参数结算完毕后其比例在0.97-1.03之间，即可放样其他碎部点。
4.RTK技术和全站仪在城市供水管线测量中的应用
4.1项目区概况
山东某农村饮水土程管线，全长60km，管线沿山势布设，沟谷多为U形，起伏较大，但视野开阔，适宜GPSRTK进行施工放样。在线路勘测时沿管线每隔3km左右布设1个GPS控制点。
4.2RTK技术在供水管线施工放样中的应用
本项目GPSRTK的使用主要是放样供水管线中线以及纵断面和横断面测量。使用中海达V9型双频接收机（1台基准站+2台移动站）作业，流动站组成为接收天线、无线电台、电池、碳纤杆、7400手簿及手簿拖架；基准站包含GPS接收天线、终端、传感器、大功率的电台、电池、5m高的无线电发射天线。
首先选取间距大于500m的3个导线点，在无参数的状态下安置好仪器，架好基准站，持流动站测量另外2个导线点，得到的数据为当地坐标（BLH）。将当地坐标对应工程坐标输入手簿，经计算求得转换参数（四参数），转化为WGS-84坐标系。
放样前需要输入的数据有路线直曲线要素的起讫桩号、半径、缓和曲线长度等，计算生成放样数据，自动保存在RTK文件的目录下。手簿程序有检核功能，若输入数据错误，手簿桌面上会有文字提示。放样时，需要从放样点库中提取所需段落，选中放样点。确定一台流动站放样中桩，选择一个桩号后，GPSRTK马上会提示目前位置距桩号位置距离及方向。实箭头方向与虚箭头方向重合时，表明行走的路线正确；如当前位置距离桩号位置小于先设置好的精度响应范围时（如50cm），仪器会发出“嘀滴”声。从GPSPTK看出当前位置与桩号位置的前后、左右或东西、南北的距离为零时，表明放样成功，即可钉桩。然后按下一个点，实行下一个点的放样。
以此类推。所有测量数据（桩号、高程、桩位、坐标）也可以用CAD或文本文件的形式导出。用另一台流动站按照数据采集模式采集整桩、加桩和横断面地形变化点的三维坐标。
4.3内业成图
将RTK与计算机进行连接，将数据导入到计算机，并转换为CASS绘图格式数据。在CASS中绘制供水管线的横断面图和纵断面图。
5.结语
RTK技术实现了实时平而和高程测量达到厘米级的精度，而所测数据山控制器直接传入到了计算机内，其间没有造成精度损失，与常规方法比较，减少了人为ICI素的十扰RTK技术还减轻了外业作业人员的劳动强度.减少了作业人员的数量，同时却人人提高了作业速度随着对RTK技术的研究和应用，改变了线路测量的传统作业模式，带来了次技术革命RTK测量技术在各种供水管线测量中取得了明撤的经济效益畴
[1]朱建荣；党仁民.GPSRTK在供水管线测量中的应用研究.矿山测量.2013（04）
关键词：运动医学；力竭运动；核因子-κB；诱导型一氧化氮合酶；软骨；创伤性骨关节炎；大鼠
EffectsofhighintensityexhaustiveexerciseandPDTCinterventiononrat’s
articularcartilageinjuryaswellasNF-κBsignalpathwayexploration
HUANGWei
（SchoolofPhysicalEducation，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450044，China）
Keywords：sportsmedicine；exhaustiveexercise；NF-κB；iNOS；cartilage；traumaticosteoarthritis；rat
1材料和方法
1.1实验动物
3月龄SPF级雄性SD大鼠40只，体质量240～300g，购自中国人民军事医学科学院实验动物中心，分笼饲养，饲养笼选择塑料制品，并配有不锈钢罩、塑料吸水瓶和金属吸水管，环境温度为15～16℃，国家标准固体混合饲料喂养，自由进食水。
1.2分组及实验干预
所有大鼠安静饲养3d，以适应新环境；然后进行3d适应性跑台运动（10m/min，15min/d）；休息1d后开始实验。
1.3组织取材和HE染色
实验结束后2h，用质量分数为3%巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，进行以下操作：（1）关节液的提取。右膝关节剪毛、消毒，于髌韧带外侧用1mL注射器施行膝关节穿刺证实刺入关节腔后，注入生理盐水0.5mL，反复回抽3次后，将液体抽出并注入EP管内，3000r/min离心10min，取上清液，-20℃保存待测NO含量。（2）于右侧膝关节切开关节囊，精心剥离膝关节周围的肌肉和韧带等组织，用咬骨钳将股骨、胫骨内外髁软骨取下，注意不要伤及软骨表面。生理盐水冲洗后，将组织分为2份，一份用液氮预冷后转入-80℃低温冰箱冻存待测基因表达；另一份用质量分数为4%多聚甲醛固定48h后常规脱钙液（质量分数为10%EDTA）脱钙，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。沿标本纵轴切片，4μm连续切片。HE染色，光镜观察软骨形态学变化（软骨表面是否规则、有无裂隙，细胞数量、分布、排列是否规则，潮线是否完整）并参考Mankin’s评分标准[14]对HE染色标本进行评分（分别由3名病理学专家单独评分，取均值）。
1.4关节液NO浓度测定
取出装有关节液的EP管，采用硝酸还原酶法测定NO浓度，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，严格按照试剂盒说明操作，测试仪器：722型分光光度计（上海市第三分析仪器厂）。单位：μmmol/L。
1.5iNOS和MMP-13mRNA表达水平测定
iNOS和MMP-13mRNA表达用实时荧光定量PCR技术测定。方法为：称取100mg软骨组织匀浆后用RNA提取试剂盒（美国Promega公司；Trizol法）抽提细胞总RNA，反转录得到cDNA（逆转录试剂盒购自美国Promega公司）。利用Primer5.0设计上下游引物，见表1。将cDNA样品配置于Real-timePCR20μL反应体系中，混合离心后置于7500型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）中进行扩增反应，反应条件：94℃预变性4min，40个PCR循环（94℃，20s；58℃，30s；72℃，10s），最后72℃延伸5min。依据循环阈值（CT值）计算各基因的相对表达量（C组的倍数）。β-actin为内参基因。
1.6iNOS、MMP-13蛋白表达水平测定
iNOS、MMP-13酶原（pro-MMP-13）和活性MMP-13（active-MMP-13）蛋白表达用蛋白质印迹（westernblot）法测定。方法为：称取100mg软骨组织匀浆后用细胞质裂解液裂解细胞，BCA法测定蛋白浓度，取50μg蛋白上样到质量分数10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳，转移至PVDF膜，质量分数5%BSA室温下封闭2h，加一抗（iNOS稀释1︰1000，pro-MMP-13、active-MMP-13和β-actin均为1︰2000）（美国Santacruz公司）4℃过夜，PBS洗膜3次。二抗用HRP标记的IgG（1︰2000稀释）（美国Santacruz公司），37℃孵育1h，PBS洗膜3次，转膜、显色。用ImageQuantTL软件对目的蛋白进行光密度分析，计算各蛋白的相对表达量（C组的倍数）。β-actin为内参蛋白。（稀释均为体积比）
1.7NF-κB与DNA结合活性测定
用凝胶电泳迁移率分析（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）测定NF-κB与DNA结合活性。方法为：首先按照细胞核提取试剂盒（美国Pierce公司）提取白，然后根据EMSA试剂盒（美国Pierce公司）说明进行。20μg白和生物素标记的含有公认的NF-κB结合位点的DNA探针（正义链：5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’，反义链3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’）（上海博尚生物技术有限公司合成）混合，总体积20μL，室温静置20min。采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（100V，1h），转移到尼龙膜上，紫外灯下交联15min，洗膜，滴加化学发光底物，在暗室中把X光片曝光并洗像观察结果，以积分灰度值表示NF-κB与DNA的结合活性（C组的倍数）。样本中同时设立阴性对照（反应体系中未加白，只有标记的DNA探针）作为探针位置的标志和冷探针竞争对照（在C组中加入过量的未标记的NF-κB竞争探针）以验证探针与NF-κB结合的特异性。
1.8统计学处理
数据以均数±标准差（±s）表示，用SPSS14.0统计软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析（one-wayANOVA），Bonferroni进行多重比较。P
2结果及分析
2.1实验动物数量
实验过程中，E组出现1只动物拒跑，EP组出现1只拒跑、1只死亡。因此，最终纳入数据统计分析的样本量分别为：C组（n=10只），P组（n=10只），E组（n=9只），EP组（n=8只）。
2.2HE染色和Mankin’s评分
C组为正常软骨组织，表面平整光滑无破损，软骨细胞核呈蓝色、排列整齐，基质呈淡粉色，着色均匀，潮线清晰Mankin’s评分（0.85±0.04）；P组形态学表现同C组，Mankin’s评分（0.76±0.06）与C组无显著性差异；E组可见软骨表面粗糙，细胞出现轻度变形或排列紊乱，孔隙不均匀增大，Mankin’s评分（3.12±0.14）高于C组和P组（P
2.3各组关节液NO浓度的变化
P组关节液NO浓度与C组无显著性差异（P>0.05）；E组和EP组关节液NO浓度较C组分别升高了176.6%（P
1）与C组比较，P
图1各组关节液NO浓度的比较
2.4各组iNOS和MMP-13mRNA表达的变化
各组iNOS和MMP-13mRNA表达的变化规律基本一致，即P组与C组无显著性差异（P>0.05）；E组（iNOS：+215%，P
图2各组iNOS和MMP-13mRNA表达的比较
2.5各组iNOS、pro-MMP-13和active-MMP-13蛋白表达的变化
pro-MMP-13蛋白水平在各组均无显著性差异。iNOS和active-MMP-13的变化趋势一致，即P组与C组无显著性差异（P>0.05）；E组（iNOS：+242%，P
图3各组iNOS、pro-MMP-13和active-MMP-13蛋白表达的比较
2.6各组NF-κB与DNA结合活性的变化
EMSA图像显示，有浓黑的生物素标记探针自由带（lane1～6）及深浅不一的蛋白质-DNA结合条带（lane2、4、5、6），游离的生物素标记DNA探针在电泳图的最下端。样本中无白的阴性对照（lane1）仅有自由带，无结合带。C组（lane2）在电泳图中部出现一条蛋白与DNA探针结合后的阻滞带。冷探针竞争对照（lane3）为C组加过量非标记探针做竞争实验，在原来出现蛋白-DNA结合带的位置无条带出现，说明此带是NF-κB与DNA结合的特异带。P组（lane4）与C组光密度值无显著性差异（P>0.05），E组（lane5）和EP组（lane6）显著高于C组（E组：+240%，P
图4各组NF-κB与DNA结合活性的比较
3讨论
3.1运动性关节软骨损伤模型的建立
3.2iNOS/NO/MMPs信号途径在TOA发病机制中的作用
3.3一次力竭运动通过NF-κB信号途径介导iNOS表达上调
NF-κB是由p50和p65亚基构成的异源二聚体，是细胞信号转导通路中的重要转录因子。生理条件下NF-κB与其抑制蛋白IκB在胞浆中结合，从而抑制NF-κB的核转位，使其处于失活状态。当细胞受到刺激时，IκB被上游的IκB激酶（IKK）磷酸化而降解，IκB与NF-κB分离，NF-κB激活并转移至胞核内促进众多基因转录，参与调控机体的免疫应答、炎症反应和细胞的生长发育等过程。
关节软骨内高浓度NO是造成软骨细胞凋亡和软骨基质降解的重要机制[3]，而力竭运动时软骨细胞iNOS表达上调是NO大量产生的主要原因，本研究则证实，NF-κB对于iNOS表达的转录调控是运动诱导NO过量产生的关键环节。最近的研究发现，过量的NO反过来又可激活p38-MAPK，p38-MAPK通过磷酸化IKK继续活化NF-κB[31-32]，从而形成对NF-κB的正反馈调节。因此，NF-κB信号途径参与了运动诱导软骨损伤的病理过程。
力竭运动造成的关节损伤是TOA形成的重要原因。一次大强度力竭运动通过NF-κB信号途径介导iNOS表达上调，促进NO大量释放和MMP-13激活，从而参与了软骨损伤的过程。
[1]MolloyMG，MolloyCB.Contactsportandosteoarthritis[J].BrJSportsMed，2011，45（4）：275-277.
[2]孙炜，王吉兴，金大地，等.一氧化氮合酶抑制剂对软骨修复组织胶原表达的影响[J].中华关节外科杂志：电子版，2009，3（6）：745-749.
[3]AbramsonSB.Osteoarthritisandnitricoxide[J].OsteoarthritisCartilage，2008，16（Suppl2）：S15-20.
[4]ChengAW，StablerTV，BolognesiM，etal.SelenomethionineinhibitsIL-1betainduciblenitricoxidesynthase（iNOS）andcyclooxygenase2（COX2）expressioninprimaryhumanchondrocytes[J].OsteoarthritisCartilage，2011，19（1）：118-125.
[5]ZhongM，CarneyDH，JoH，etal.InorganicphosphateinducesmammaliangrowthplatechondrocyteapoptosisinamitochondrialpathwayinvolvingnitricoxideandJNKMAPkinase[J].CalcifTissueInt，2011，88（2）：96-108.
[6]LizarbeTR，Garcia-RamaC，TarinC，etal.NitricoxideelicitsfunctionalMMP-13protein-tyrosinenitrationduringwoundrepair[J].FASEBJ，2008，22（9）：3207-3215.
[7]YangL，GuoA，GuJC.c-JunN-terminalkinaseandnuclearfactorkappaBmediatenitricoxide-inducedexpressionofmatrixmetalloproteinase-13[J].IntOrthop，2011，35（8）：1261-1266.
[8]ZaragozaC，Lopez-RiveraE，Garcia-RamaC，etal.Cbfa-1mediatesnitricoxideregulationofMMP-13inosteoblasts[J].JCellSci，2006，119（Pt9）：1896-1902.
[9]HaydenMS，GhoshS.NF-kappaB，thefirstquarter-century：remarkableprogressandoutstandingquestions[J].GenesDev，2012，26（3）：203-234.
[10]RuimiN，RwashdehH，WasserS，etal.DaedaleagibbosasubstancesinhibitLPS-inducedexpressionofiNOSbysuppressionofNF-kappaBandMAPKactivitiesinRAW264.7macrophagecells[J].IntJMolMed，2010，25（3）：421-432.
[11]胡亚哲，扈盛.大鼠跟腱末端病的细胞凋亡的检测[J].中国中医骨伤科杂志，2000，8（1）：9-11.
[12]戴国钢，刘波，罗小兵，等.兔膝关节软骨表面形态在短时非周期大强度运动训练后的变化[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（36）：7146-7148.
[13]刘波，戴国钢，马建，等.大强度运动和中医治疗对兔膝关节软骨IL-1、TNF、PGE2的影响[J].中国运动医学杂志，2004，23（3）：304-306.
[14]MoodyHR，HeardBJ，FrankCB，etal.Investigatingthepotentialvalueofindividualparametersofhistologicalgradingsystemsinasheepmodelofcartilagedamage：theModifiedMankinmethod[J].JAnat，2012，221（1）：47-54.
[15]高丽霞，张奉春.运动与骨关节炎[J].中华风湿病学杂志，2007，11（2）：114-117.
[16]KimHA，LeeKB，BaeSC.Themechanismoflow-concentrationsodiumnitroprusside-mediatedprotectionofchondrocytedeath[J].ArthritisResTher，2005，7（3）：R526-535.
[17]ChangK，LeeSJ，CheongI，etal.Nitricoxidesuppressesinduciblenitricoxidesynthaseexpressionbyinhibitingpost-translationalmodificationofIkappaB[J].ExpMolMed，2004，36（4）：311-324.
[18]Maki-PetajaKM，CheriyanJ，BoothAD，etal.Induciblenitricoxidesynthaseactivityisincreasedinpatientswithrheumatoidarthritisandcontributestoendothelialdysfunction[J].IntJCardiol，2008，129（3）：399-405.
[19]夏志，汪清祥，黄涛，等.一氧化氮和一氧化氮合酶与运动训练[J].首都体育学院学报，2009，21（1）：83-87.
[20]Lopez-RiveraE，LizarbeTR，Martinez-MorenoM，etal.Matrixmetalloproteinase13mediatesnitricoxideactivationofendothelialcellmigration[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102（10）：3685-3690.
[21]IyerRP，PattersonNL，FieldsGB，etal.Thehistoryofmatrixmetalloproteinases：milestones，myths，andmisperceptions[J].AmJPhysiolHeartCircPhysiol，2012，303（8）：H919-930.
[22]ZhaoZ，JiH，JingR，etal.Extracorporealshock-wavetherapyreducesprogressionofkneeosteoarthritisinrabbitsbyreducingnitricoxidelevelandchondrocyteapoptosis[J].ArchOrthopTraumaSurg，2012，132（11）：1547-1553.
[23]陈艳梅，郝选明.运动训练对核转录因子kappaB信号通路及炎性基因影响的研究进展[J].体育学刊，2011，18（3）：140-144.
[24]JiLL，Gomez-CabreraMC，SteinhafelN，etal.Acuteexerciseactivatesnuclearfactor（NF）-kappaBsignalingpathwayinratskeletalmuscle[J].FASEBJ，2004，18（13）：1499-1506.
[25]BrooksSV，VasilakiA，LarkinLM，etal.RepeatedboutsofaerobicexerciseleadtoreductionsinskeletalmusclefreeradicalgenerationandnuclearfactorkappaBactivation[J].JPhysiol，2008，586（16）：3979-3990.
[26]LiaoP，ZhouJ，JiLL，etal.Eccentriccontractioninducesinflammatoryresponsesinratskeletalmuscle：roleoftumornecrosisfactor-alpha[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol，2010，298（3）：R599-607.
[27]Jimenez-JimenezR，CuevasMJ，AlmarM，etal.EccentrictrainingimpairsNF-kappaBactivationandover-expressionofinflammation-relatedgenesinducedbyacuteeccentricexerciseintheelderly[J].MechAgeingDev，2008，129（6）：313-321.
[28]LeongDJ，LiYH，GuXI，etal.PhysiologicalloadingofjointspreventscartilagedegradationthroughCITED2[J].FASEBJ，2011，25（1）：182-191.
[29]FanZ，TardifG，HumD，etal.Hsp90{beta}andp130（cas）：novelregulatoryfactorsofMMP-13expressioninhumanosteoarthriticchondrocytes[J].AnnRheumDis，2009，68（6）：976-982.
[30]IslamN，HaqqiTM，JepsenKJ，etal.Hydrostaticpressureinducesapoptosisinhumanchondrocytesfromosteoarthriticcartilagethroughup-regulationoftumornecrosisfactor-alpha，induciblenitricoxidesynthase，p53，c-myc，andbax-alpha，andsuppressionofbcl-2[J].JCellBiochem，2002，87（3）：266-278.