本期中国实验动物信息网特邀南京大学模式动物研究所赵庆顺教授为大家讲解在模式动物中如何使用CRISPR/Cas9技术，内容包括利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入实验动物的过程和设计原则、CRISPR技术的明显优势与存在待解决或改进的技术问题、以及CRISPR技术的伦理学问题等。
中国实验动物信息网：以CRISPR/Cas9为代表的基因组编辑技术已广泛应用于人、动植物（细胞）以及细菌等微生物的基因组靶向改造，请赵教授您谈谈当前CRISPR/Cas9技术在实验动物、疾病模型以及基因治疗等不同领域开展了哪些应用研究？
赵庆顺：作为自20世纪70年代生物技术时代开启以来最重要的遗传工程技术，CRISPR/Cas9因为在运用上没有物种限制、技术简单、易于操作、基因组编辑成功率高，已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、猪、羊、水稻、小麦、玉米和拟南芥等动植物以及细菌等微生物的基因组靶向改造。运用CRISPR/Cas9技术，可以按照使用者的要求，实现对生物体基因组的插入、删除、或替换的基因组编辑。CRISPR/Cas9技术已成为后基因组时代功能基因组研究、动植物品种改良、疾病模型建立以及基因治疗等不同领域中强有力的遗传工程利器。
在模式动物研究上，CRISPR/Cas9技术改变了过去只能通过传统的基因打靶技术在小鼠基因组上进行基因靶向突变的技术限制。运用CRISPR/Cas9技术，可以对包括线虫、果蝇、斑马鱼、爪哇、小鼠、大鼠等所有模式动物的基因组进行插入、删除、或替换的基因组编辑，这一运用将极大地有利于功能基因组的研究，加速在整体水平上解析基因功能的速度，加深对基因功能的认识。
随着人类功能基因组学研究的深入，越来越多的人类疾病的分子遗传机制得以解析。运用CRISPR/Cas9这一强有力的遗传学技术，在模式动物基因组上对人类疾病致病基因的同源基因进行基因组编辑，可以重现人类疾病的症状。这种以遗传学方法建立的疾病模型将有利于病理机制解析以及药物筛选，有助于快速建立疾病诊疗手段。
基因组编辑技术的出现，为以基因治疗方法治愈疾病提供了十分光明的前景。自2008年第一代基因组编辑技术（锌指核酸酶）出现以来，已有如针对艾滋病在内的多种基因组编辑药开始了临床试验。全世界众多医药公司纷纷参与以基因组编辑药为特征的基因治疗研究。例如：由CRISPR技术发明者之一张峰参与的、成立于2014年的Editas公司宣布在今年开展用于治疗利伯先天性黑朦病（Lebercongenitalamaurosis（一种遗传性视力衰退疾病）的CRISPR基因编辑临床人体实验。理论上，已知由基因突变造成的分子遗传病未来都能应用基因组编辑技术进行有效的治疗。
中国实验动物信息网：我们了解到您在利用CRISPR/Cas9技术方面已有很丰富的经验，还长期为学员传授CRISPR/Cas9技术，请您介绍一下利用CRISPR技术创建基因敲除或敲入实验动物的过程以及设计原则？需要注意哪些关键点？
综上所述，基因组编辑的特征在于由Cas9/sgRNA在目标基因组位置上首先制造DSB；一旦形成了DSB，细胞将针对DSB启动修复机制使得突变细胞在目标基因组位置上出现插入、缺失以及替换的基因组编辑结果。在此基础上，通过对突变细胞（或突变个体）的筛选，可以获得基因组编辑突变体。
依据上述工作原理，运用CRISPR/Cas9技术制作基因敲除或敲入动物的基本过程可以简单描述为：
1）目标基因的基因组组成分析
基因组编辑是在细胞的基因组水平上进行的遗传操作，而基因的功能是通过其表达产物实现的。因而了解目标基因的基因组组成，分析其表达产物与基因组上对应的外显子和内含子之间的关系，对于设计sgRNA的靶向识别序列CRISPR是十分重要的。
2）CRISPR的设计
根据基因的表达产物不同，CRISPR的设计有所不同。对于那些表达产物最终为蛋白质的基因而言，建议将CRISPR序列设计在编码蛋白质关键功能结构域对应的外显子上；如果没有典型的关键功能结构域，则建议设计在整个蛋白质序列长度的大约三分之一处对应的外显子上。对于表达产物为ncRNA，由于不存在移码突变的问题，建议在目标关键序列两端分别设计CRISPR，识别两个CRISPR序列的sgRNA同时使用可实现对目标关键序列的删除。
为提高基因组编辑效率，对于靶向突变哺乳动物基因，一般一次设计3个CRISPR；而对于靶向突变斑马鱼基因，一般一次性设计4个CRISPR。在设计这些CRISPR时，建议序列相互不要重叠，CRISPR之间的距离也不要太远（一般不超过200bp）。
3）基因组编辑工具的制备
如前所述，基因组编辑工具含有Cas9和sgRNA两个成分。Cas9以蛋白质形式、sgRNA以RNA形式发挥作用。因此，基因组编辑工具可以DNA（如同时携带Cas9、sgRNA和筛选标记基因表达构件的All-in-One质粒）、RNA（Cas9mRNA和sgRNA）、以及RNP（Cas9蛋白与sgRNA的混合物）等三种形式呈现。DNA形式的基因组编辑工具的制作以及递送至细胞内的方法均较为简单，具有常规的分子生物学技术即可实施，常用于基因敲除/敲入细胞系的建立；RNA形式的基因组编辑工具的制备与递送需要熟练的分子生物学技巧，特别是RNA生物学的技巧，一般用于注射动物受精卵，以制备基因组编辑突变个体。由于现在很多商业公司有Cas9蛋白可供出售，因此使用RNP形式基因组编辑工具注射动物受精卵制备基因组编辑突变体更为方便，也更为有效。
4）CRISPR的活性验证
已有的研究表明，在小鼠受精卵中，大约80%的sgRNA可有效引导Cas9靶向切割小鼠基因组DNA。而斑马鱼中，这一比例可能只有50%左右。因此，在正式开始基因组编辑前，推荐先行进行sgRNA活性测试。
由于不是每个sgRNA都有活性，因此，设计多个CRISPR以制备多个sgRNA同时进行活性验证，对于提高基因组编辑成功率是有益的。
sgRNA活性测试可以使用商售Cas9核酸内切酶在体外直接执行。但体外验证有活性并不能代表其在体内一定有活性，因此需要用细胞系或受精卵（如斑马鱼受精卵）作为反应器来进行体内活性验证。
5）用于基因敲入的供体DNA的设计
如果要敲入的外源片段较小，如点突变、标签序列、loxp序列，建议设计单链DNA(ssDNA)供体。设计单链供体时，需要在目标插入片段的两侧各加50-70nt的同源臂。如果要敲入的外源片段较大，需要设计双链供体。设计双链供体时，在目标敲入片段两侧各加上长度不短于2kb的同源臂。双链供体一般以克隆载体形式与基因组编辑工具共递送至细胞（或受精卵）内。
6）基因组编辑工具递送至受精卵中建立初建者
采用显微注射（小鼠受精卵现在可采用电转）方式，将基因组编辑工具（RNA或RNP形式）（如果进行基因敲入，需要共注射同源供体）注射到动物的受精卵内。然后，将受精卵孵育饲养，建立基因组编辑初建者F0（Founder）。
7）初建者体细胞携带靶向突变等位基因的确认
无创采集F0的体细胞（组织），PCR扩增含靶向突变目标序列的基因组DNA片段，鉴定F0的体细胞中是否含有编辑子。如有，则可用于传代。
8）基因敲除（基因敲入）动物（F1）的鉴定
F0传代得到F1代动物，待F1代生长至可提供无创伤检材时，进行F1代的基因型鉴定，以筛选符合设计要求的基因组编辑突变体。推荐由F0自交生产F1，这样有机会在F1代即可观测到目标基因纯合突变时是否致死。
9）基因敲除（基因敲入）动物品系（F2）的建立
建议将筛选到的F1基因组编辑突变体与野生型以外交形式进行传代，建立基因组编辑突变体品系。
中国实验动物信息网：据我们所知，与ZFN、TALEN等工具相比，CRISPR技术具有明显优势，但目前比较大的一个缺陷就是脱靶问题，您可否介绍一下脱靶的产生原因，及当前研究者解决脱靶问题的主要方法？
赵庆顺：实际上其它基因组编辑技术也存在脱靶问题，只是现在大家的注意力都集中在CRISPR技术上。譬如，现在仍在使用的TALEN技术事实上也存在脱靶问题（有时还很严重---未发表数据）。当然，这不意味着我们无需重视脱靶问题。
脱靶源于CRISPR序列的相似性。研究表明，CRISPR序列的20个nt中即使错配4个nt，亦能产生脱靶现象；其中远离PAM的8个核苷酸与sgRNA的错配更容易容忍sgRNA的识别，从未造成脱靶。此外，对于sgRNA识别的CRISPR序列而言，缺少或多出1个核苷酸也可能造成sgRNA的错误识别，导致脱靶。
在实际研究中，对于不同领域的使用者，脱靶问题的意义不同。例如从事基础研究的研究者，通常并不需要特别担心脱靶问题。在获得基因组编辑突变个体（或细胞系）前，建议不要去考虑脱靶问题。在获得突变体后，再针对候选的脱靶基因进行基因型鉴定以排除携带脱靶基因突变的突变体。对于基因组编辑动物个体而言，由于其行有性生殖，即使有脱靶，只要其与目标基因不连锁，经传代即可实现分离。
第二、sgRNA活性的预测。在CRISPR的设计上，尽管有研究表明可以对sgRNA活性进行预测、有在线设计网站声称可以帮助设计有活性的sgRNA，但应该说这些研究可能更多地依赖于对已有数据的统计。目前尚缺乏预测sgRNA活性的理论依据。如果能够有效预测sgRNA活性，将极大地方便CRISPR技术的应用。
第三，更为有效的基因组编辑工具特别是RNP的递送方法。虽然这看上去与基因组编辑技术无关，但已有的研究表明，基因组编辑工具的RNP形式工作效率优于RNA形式，而RNA形式又优于DNA形式。事实上，基因组编辑工具的递送极大地影响了CRISPR技术在非模式生物上的运用，因为非模式生物常常缺乏有效的遗传操作平台。无论是RNA形式还是DNA形式，就Cas9而言均存在着物种使用的密码子偏好性问题。要想有效表达Cas9蛋白，必须优化Cas9的密码子，但这对于缺乏基因组信息的物种来说是一件十分困难的事。就DNA形式而言，Cas9和sgRNA的表达还存在物种特异的启动子问题。但是，如果能开发出更为有效的RNP递送方式，那么CRISPR技术在不同物种中的运用将变得十分便利。
中国实验动物信息网：已有报道显示，CRISPR技术可用于对人生殖细胞或早期胚胎细胞进行基因组编辑，这引发了巨大的伦理学争议。您是如何看待CRISPR技术的伦理学问题？
就我个人而言，支持运用CRISPR技术治疗人类体细胞疾病，但坚决反对以消除重要遗传病为名，将CRISPR技术应用于以生育为目标的人生殖细胞或早期胚胎的基因组编辑。如前所述，基因组编辑技术存在着脱靶问题；并且，我们对这一技术本身了解的并不充分。允许经基因组编辑的人类出生，意味着人类将会以前所未有的方法对我们人类自身的基因组进行可遗传的人为干预，其未知性所导致的后果对人类来说有可能是灾难性的。因此，国际社会应该严厉禁止利用CRISPR技术改造人类的基因组。如同禁止将克隆技术用于"克隆人"一样，禁止应用基因组编辑技术制造"基因组编辑人"。
虽然我们已进行了很多的尝试，但到目前为止还没有能够找到解决SGN在细胞内基因组编辑效率问题的办法，这一致命的缺点限制了其在基因组编辑上的运用。我们现在仍在努力继续优化该系统。