2、可避免未切断质粒被PCR扩增（短时延伸20秒)见后面）。这些质粒在E.coliDH10B繁殖。2.2CRISPR/Cas9双元载体(单子叶植物用)pYLCRISPR/Cas9-MH，原命名pYLCRISPR/Cas9-MTmono(M=monocot;H=HPT，抗潮霉素基因)pYLCRISPR/Cas9-MB(B=Bar,抗草苷膦基因)本套载体系统的pCas9为本实验室设计合成的植物优化密码子基因。双元载体骨架（LBRB非T-DNA序列）为pCAMBIA-1300(ACCESSION:AF234296)与以前的载体相比，这2个载体改造了原来的融合型ccdB即LacZ/cc
3、dB为ccdBs(shortenccdB,即删除了LacZ序列)及其相对方向反过来，其它部分不变。注：这些质粒保存在E.coliTOP10F(LacIq)菌株繁殖，以使ccdB(大肠杆菌致死基因)能够被LacIq产生高水平阻碍蛋白抑制其表达。3.基因组靶位点选择和双链接头设计3.1靶位点选择（1）在目标区如果能够找到NGG上游第20碱基是A（用U3启动子）或G(用U6ac启动子）的序列(A，G分别为U3和U6启动子的转录起始碱基），优先选为靶序列合成接头的形式（左：连接U3启动子；右：连接U6a启动子）注意：接头正向引物F和反向R命名命名是根据靶点在gRNA表达盒的连
4、接方向决定，不是基因方向决定，否则这些引物用于检测阳性克隆时容易搞错方向;另外注意设计引物（尤其反向引物）时的5-3方向。（2）如果在NGG上游第20碱基不是A或G，可选20碱基为靶序列（参考KabinXieandYinongYang，2013，MolecularPlant)合成接头的形式（连接U6a启动子）也就是说，所用启动子的转录起始点与NGG上游第20碱基相同的靶点就是19碱基(19+A/G=20)，不相同的靶点就是20碱基。（3）为了提高突变效率，可以对一个目的基因设计2个靶点(尤其只有一个靶基因)。建议在ORF5区和功能结构域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变
5、都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。靶点序列GC%偏高可提高打靶效率，因此靶点最好含有11-14个C/G（包括U6转录起始点G）。几个靶位点设计例：左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF上游，或在特定的功能域(可能引起密码子缺失和移码)右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）（4）靶点特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一产生有负面作用的非特异打靶，把突变体与原受体亲本杂交（和回交）就可分离排除非特异打靶位点），但应该将候选靶序列+NGG（上下游加几十碱基）对目标基因组做Blast(选Somewhatsimilar
6、sequences(blastn)，避免在靶序列3端+NGG与其它功能基因和基因组序列有相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。3.2靶位点接头引物设计例4.多靶点pYLCRISPR/Cas9-MH(B)载体构建4.1gRNA表达盒构建示意图4.2靶点引物接头与gRNA表达盒的实际连接方式和扩增为了提高接头连接效率，使用较高浓度（0.05-0.1mM）的靶点接头，实际上大部分产生线性单端连接，而环状(双端)连接较少。另外，过度酶切，星活性，过度连接等可能产生破坏的平滑末端，有可能连接产生双接头产物或的空载产物（下图的产
7、物IV和产物V）。连接接头后，有3种方法扩增gRNA表达盒片段：（1）直接用位置特异引物做一轮PCR扩增;（2）做2轮巢式PCR，第一轮PCR用通用的U-F/gRNA-R做1个反应，第二轮用位置特异引物扩增；（3）做2轮巢式PCR，第一轮PCR做2个反应，分别用U-F/接头反向引物，和用接头正向引物/gRNA-R；第二轮为OverlappingPCR,用位置特异引物扩增出表达盒产物。方法（1）效果不那么稳定，且不能避免扩增下图的产物IV和产物V。方法（2）的扩增效果好且稳定，但同样不能避免扩增产物IV和产物V。方法（3）虽然第一轮PCR需要做2个反应，但效果最好且能避免扩增产物IV和产物V
8、，因此推荐使用方法（3）。下图为方法（3）示意图。在第一轮PCR加热过程中（73-75度），有缺口的引物（Tm值低于U3/6和gRNA序列）先解离，U3/6和gRNA序列3端（未解离）立即延伸补平，产生接头引物互补结合位点。4.3gRNA表达盒扩增引物第一轮PCR扩增引物（所有gRNA表达盒共用）：U-F:5-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3;gRNA-R:5-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3第二轮PCR扩增引物（使用策略IGoldenGateligation的位置特异gRNA表达盒专用）：（B1,B2,B2,B3,B3等表示各连接点位置；
9、ctcg,tcag等表示BsaI切点粘性末端的正链序列;相同颜色的BsaI切点粘性末端是可特异配对连接的互补末端）靶点1（T1）：SpeI（new）Uctcg-B1:TTCAGAggtctcTctcgACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（U3/6上游引物）gRctga-B2:AGCGTGggtctcGtcagGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3（第二轮gRNA下游引物）T2:Uctga-B2:TTCAGAggtctcTctgaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRaaga-B3:AGCGTGggtctcGtcttGGTCCATCCACTCC
10、AAGCTC-3T3:Uaaga-B3:TTCAGAggtctcTaagaCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRgact-B4:AGCGTGggtctcGagtcGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T4:Ugact-B4:TTCAGAggtctcTgactCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRggac-B5:AGCGTGggtctcGgtccGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T5:Uggac-B5:TTCAGAggtctcTggacCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRtctg-B6:AGCGTGggtctcGcaga
11、GGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T6:Utctg-B6:TTCAGAggtctcTtctgCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRaggt-B7:AGCGTGggtctcGacctGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T7:Uaggt-B7:TTCAGAggtctcTaggtCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gRcgct-B8:AGCGTGggtctcGagcgGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3T8:Ucgct-B8:TTCAGAggtctcTcgctCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(如果要多于8个靶点，通过设计不同的
13、向重复序列间能够发生同源配对的碱基对数少于该重复序列长度的1/2）。因此建议U3、U6ac启动子的使用和排列方式为：1个靶点：LacZ-U32个靶点：LacZ-U3U6a3个靶点：LacZ-U3U6aU6b4个靶点：LacZ-U3U6aU6cU6b5个靶点：LacZ-U3U3U6aU6cU6b6个靶点：LacZ-U3U3U6aU6aU6cU6b7个靶点：LacZ-U3U3U6aU6aU6bU6cU6b8个靶点：LacZ-U3U3U6aU6aU6bU6bU6cU6c靶点接头设计：由于靶点接头的正向引物的5端4个碱基是根据使用的不同启动子而不同的，因此要确定那个靶点使用那个启动子的基础上合成其正向
14、引物。特定位置gRNA表达盒引物使用方法(U#=U3,U6ac)：1个靶点：用引物对B1/BL扩增相应的U#-T1-gRNA;2个靶点：用引物对B1/B2,B2/BL扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA;3个靶点：用引物对B1/B2,B2/B3,B3/BL扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA;4个靶点：用引物对B1/B2,B2/B3,B3/B4,B4/BL扩增相应的U#-T1-gRNA,U#-T2-gRNA,U#-T3-gRNA,U#-T4-gRNA5个或以上靶点：如此类推。4.5靶标gRNA表达盒
15、与pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的连接方法本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的一次连接组装：策略I用GoldenGatecloning(ligation)方法(Engleretal.,2008;2009)；策略II用Gibsonassembly方法(Gibson,etal.,2009,2010)。GoldenGateligation是利用BsaI(typeIIsrestrictionenzyme)的识别位点和切割位点不重叠的特性，可以设计出多种不同的且非回文结构的粘性末端（256-16=240种，减去的16种
16、是回文结构；第6-7页的PCR扩增引物使用了16种）。多个要连接的片段在连接点具有特异的互补末端可以连接（如下图,4个表达盒为例)，而非连接点的末端之间不互补不能连接（相同末端分子间也不互补不能连接），因此连接反应是向着目标单方向进行，效率很高。由于OsU3上游附有LacZ标记基因(198bp)，可在含有X-gal的培养基产生蓝色菌斑筛选阳性克隆，达到绝对真阳性。策略II见后面介绍。操作流程图注：由Uctcg-B1导入的载体唯一SpeI位点是特别留的一个“后门”，其用途是，在构建好一组目的靶点gRNA表达盒的载体的基础上，如果情况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒，可以用SpeI将
17、载体切成线状，再用策略II（GibsonAssembly，见后面）将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。5多靶点载体构建详细操作方法（策略I）：（1）菌种活化和质粒提取制备：将pYLCRISPR/Cas9-MH(B)菌种(TOP10F)和CRISPR/gRNAvectors菌种(DH10B)分别在含有卡那霉素（25g/ml）和氨苄青霉素（50g/ml）平板培养基划出活化单菌落，取单菌落培养1ml种子液（不要将保存的菌种直接接种子液！），再扩大培养用于提取质粒。pYLCRISPR/Cas9-MH(B)载体较大（约16.5kb），拷贝数较低（pBR322复制子），用质粒小型柱提取纯
18、化的回收率较低，因此最好用适合于较大质粒提取的大柱纯化试剂盒（如TIANGEN公司EndoFreeMaxiPlasmidKit）提取纯化（由于溶出的质粒DNA可能含有残留的洗液成分即乙醇，且体积大浓度低，最好再做一次标准的乙醇沉淀操作以去除残留乙醇和减少DNA溶液体积），或用普通碱裂解法提取（用酚/氯仿抽提2次后再乙醇沉淀）。溶解在TE（约0.5mg/ml）保存。取部分质粒稀释成约100ng/ml冷冻保存，作为步骤（10）使用。由于BsaI是很容易失活的酶（有时新买的BsaI是失活的！），在进行以下步骤之前，先检测BsaI活性：配制10lBsaI反应液，含有5UBsaI,10
22、ffer中加入ATP至终浓度0.51.0mM，加入约20ngpYLgRNA-OsU#质粒（预先配好20ng/l保存），0.5l接头（最终浓度0.05M），5UBsaI，35UT4DNAligase（此buffer对BsaI和ligase都有效）。如果实验室没有ATP，在1x内切酶Buffer中加入0.20.3l10xNEBT4DNAligasebuffer（10xNEBT4DNAligasebuffer中含有10mMATP,但10xTakaraT4DNAligasebuffer中含有1.0mMATP，因此优先用NEB的；或
23、加1l10xTakaraT4DNAligasebuffer）。注意：没有加内切酶buffer而单纯加T4DNAligasebuffer缺少KCl或NaCl，不适合BsaI酶切！）。用变温循环仪（或PCR仪）循环反应5循环：375min，205min。(6)扩增gRNA表达盒（虽然用第二轮PCR的位置特异引物直接从连接产物也可以扩增出目标产物，但用2轮PCR扩增可以更稳定地得到特异性目标产物且能避免空载产物扩增，见第6页）（a）第一轮扩增（每个gRNA表达盒2个PCR反应，各15l）：取1l连接产物为模板，使用第6页引物U-F/接头反向引物（反应1），和接头正向
24、引物/gRNA-R（反应2），各0.2M,适量高保真PCR酶，最好使用KOD-Plus(TOYOBO)，保真度最高且性价比高，或KODFX，或TakaraExTaq。不要使用能在产物3附加A碱基的Taq酶，此A碱基使产物在第二轮PCR中不与互补链配对而不能延伸补平）。25-28循环：9510s，6015s，6820s(任意)取4l电泳检查（反应2产物长度约140bp，最好用PAGE检查，或用2%琼脂糖胶）。如果扩增产物较弱，也可以继续第二轮PCR。（b）第二轮PCR：按第6-7页所示，预先将位置特异引物对混合成10x工作液，每种1.5M：B1+B2
25、(PT1);B2+B3(PT2);B3+B4(PT3)；B4+B5(PT4)；B5+B6(PT5)；B6+B7(PT6)；B7+B8(PT7)；B1+BL(PT1L);B2+BL(PT2L);B3+BL(PT3L);B4+BL(PT4L);B5+BL(PT5L);B6+BL(PT6L);B7+BL(PT7L);B8+BL(PT8L)。引物组合1个靶点：PT1L；2个靶点：PT1，PT2L；3个靶点：PT1，PT2，PT3L;4个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4L;5个靶点：PT1，
26、PT2，PT3，PT4，PT5L;6个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6L；7个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7L；8个靶点：PT1，PT2，PT3，PT4，PT5，PT6，PT7，T8L取第一轮PCR反应1，2产物1l用H2O稀释10倍，各取1l混合为模板。各表达盒20-50lPCR(1个靶点50l；2-3个靶点各30l；4个或以上靶点各20l)。加入1/10量每种引物组合工作液（最终浓度0.15M）。使用适量KOD-Plus或其它高保真PCR酶。扩增15-20循环(实际情况调整)：9510s，5815s，6820s。取2
27、-3l电泳检查产物长度是否符合，并估计样品的大致浓度。注：各种启动子gRNA表达盒的长度为（括号为BsaI切后）：U3-gRNA=767bp(728bp);U6a-gRNA=629bp(599bp);U6b-gRNA=515bp(485bp);U6c-gRNA=924bp(984bp)。（7）根据各样品产物估算的量，把所有产物大致等量混合，酚抽提乙醇沉淀或用PCR产物纯化kit纯化(除去Taq酶以防止下步骤补平BsaI酶切末端)。（8）（如果采用步骤10方法II，不需要此步骤8和9）混合产物在50lBsaI反应，用20UBsaI37酶切30min，732
28、min（使切出的13bp末端小片段变性，以减少连接竞争）。用PCR产物纯化kit纯化，以去除切出的13/17碱基末端片段以防止连接竞争。（9）方法I：在切好分装（步骤2）的pYLCRISPR/Cas9-MH(B)(约60-80ng）管中，加入相当于每个靶点约10-15ng的步骤（8）酶切PCR产物(如1个靶点约10ng、2个靶点共20-30ng、3个共约40-50ng、4个共约60-70ng、更多靶点时每个片段的量适当增加（最多15ng/片段）,不要加入过多的gRNA表达盒片段。这样载体与每种插入片段摩尔比=1:4-6)，在10l连接反应（加35U连接酶，不要过多连
31、最后372min。此方法要点：由于没有去除BsaI切出的13/17碱基小片段和ccdBs片段，它们会被竞争连接回原来的位置。此变温边切边连反应能把连接回去的片段再次被BsaI切除，而连接好的目标产物序列由于不存在BsaI的识别位点不会被切断。此方法简便效率高，阳性克隆率高，推荐优先使用。（11）电激法转化：将连接产物滴载在悬浮式透析膜MilliporeVSWP04700（0.025m孔径）对1/5xTE透析1530min（最好在4冷柜内）脱盐（或用乙醇沉淀，70%乙醇洗，风干溶在5l去离子水），取1-1.5l连接产物电激转化E.coliDH10B感受态细胞（虽然其
32、它菌株也可以用，但DH10B更适合高效率电激转化大质粒。电激转化感受体态细胞制备最好用SOB培养（不要用LB培养），以10pgpUC18质粒转化测试转化效率（小质粒用电激电压1800V/20l感受态细胞/1l电激杯），要求达到效率>109colonies/1gpUC18(即电激10pg质粒，涂1/20转化细胞出500以上菌斑)。>15kb大质粒的电激电压为1500-1600V/20l感受态细胞/1l电激杯（或2500V/40l感受态细胞/2l电激杯）；电激后加入1mlSOC(不要用LB)）,37培养1-1.5h。涂板培养基为LB+25g/mlKan,0.
33、30.5mMIPTG(使用LacIq基因型菌种用1.0mM)，适量X-gal。IPTG诱导没有彻底切除ccdBs的空载质粒转化子的ccdBs表达致死。而含有目标插入序列（LacZ-OsU3-gRNA表达盒）的阳性克隆由LacZs表达产生蓝色菌斑。注意：白色且生长大小正常的菌斑是已切除ccdBs但末端破坏平端连接的空载克隆，或ccdBs功能突变（有约1/1000频率发生）但未切除ccdB的空载克隆。化学熱激法转化也可以获得阳性克隆，但效率较低。因此，有电激仪的实验室应该使用电激法。（12）阳性克隆确认：用常规碱裂解法提取质粒，取约100ng（20l反应）用MluI（由LacZ-OsU3
34、表达盒和BL引物导入MluI位点）切出串联的gRNA表达盒片段（以未切的空载环状质粒为对照）电泳检查其大小是否符合预期（各gRNA表达盒片段大小之和）。如果MluI切不动（电泳显示没有插入子片段且带型与未切空载环状质粒相似，即条带较宽拖尾），这是空载体。（如果做以下步骤测序，可不做这个PCR检测）取少量（13ng）质粒为模板对所有靶点进行PCR检测(也用空载质粒做阴性对照)。引物配对形式为：SP-DL引物与第一靶点接头反向引物配对；第一靶点接头正向引物与第二靶点反向接头引物配对；第二靶点正向接头引物与第三靶点接头反向引物配对；第三靶点接头正向引物与第四靶点反向接头引物配对；如此类推，最后
35、靶点正向接头引物与SP-R引物配对。这样每个靶点的正反方向都检测过一次。电泳确认其大小是否符合预期。（13）测序检测：（如果通过步骤12PCR检测阳性，可不做测序）利用各靶点引物的特异性，按下图方式对特定靶点进行测序.注意：由于U6c比较长（742bp），用前一个靶点正向引物不一定能测通U6c到靶序列（T#），如果U6c是最后一个表达盒，要用SP-R(见第2页)进行测序；如果U6c不是最后一个表达盒，用其后面的靶点反向引物测。（最好提醒测序公司，这是中低拷贝的较大质粒，以便公司采取相应措施）。（14）在农杆菌的稳定性检测(任意步骤)：获得的克隆电激转化农杆菌（EHA105），从农杆菌提取
36、质粒（农杆菌提取质粒质量较差，只适合做PCR），取约2-5ng质粒为模板再用所有靶点接头正向引物和反向引物配对进行PCR确认。或将质粒转化DH10B，再提取质粒酶切分析。(15)打靶效果检测：打靶成功往往在靶点缺失若干碱基。以靶点切点为中心，在两侧各离开约150bp处合成引物。可将T0或T1植株的靶点PCR产物不经克隆直接测序。从测序出现杂波峰或突变型波峰判断突变状态。策略II:基于GibsonAssembly的gRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-MH(B)的连接方法Gibson等开发了一种“isothermalinvitrorecombinationreact
37、ion”，也称为“GibsonAssembly”可进行多个PCR片段的连接(Gibson,etal.,2009;Gibson,etal.,2010;Gibson,2011)。商业的连接克隆试剂盒“GibsonAssemblyKit”(NEB)就是基于此技术,Takara的In-Fusion使用不同酶系，原理相似，也可以达到相同目的，但这些试剂盒很昂贵！（1500-1700元/10次反应）。本实验室利用自制的isothermalinvitrorecombinationreactionmixture(见以下，成本非常低)，可进行质粒载体的多个片段同时克
38、隆和缺失（Jiangetal.,2013.One-stepcloningofintron-containinghairpinRNAconstructsforRNAinterferenceviaisothermalinvitrorecombinationsystem.Planta238,325-330;Zhuetal.,2014.Robustmulti-typeplasmidmodificationsbasedonisothermalinvitrorecombination.Gene548,3942）。以下介绍基于Gi
39、bsonAssembly的CRISPR/Cas9多靶点载体的构建。(1)根据在一个载体构建靶点数的需要，合成以下引物对（gR-L是最后一个gRNA表达盒用）。以下相同颜色表示连接配对序列，右端斜体表示与U3/6启动子上游配对序列，方框为各种通用引物配对位点，测序检验阳性克隆时测序公司可以提供这些通用引物。SpeIUp-T1:ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3(下划线与GAS-L配对)gR-T1:CAGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGCACATCCACTCCAAGCTCTTG-3(Ptacprom
40、oterFprimersite)Up-T2:GTGCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T2:CCACGCATACGATTTAGGTGACACTATAGCGCATCCACTCCAAGCTCTTG-3(Sp6promoterprimersite)Up-T3:CGCTATAGTGTCACCTAAATCGTATGCGTGGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T3:GTCGCTAGTTATTGCTCAGCGGCCAAGCTCATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T7terminatorFprimer
41、site)Up-T4:GAGCTTGGCCGCTGAGCAATAACTAGCGACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T4:CATCGTCGCCGTCCAGCTCGACCATTGAACATCCACTCCAAGCTCTTG-3(EGFP-Nprimersite)Up-T5:GTTCAATGGTCGAGCTGGACGGCGACGATGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T5:GCTCCGAATACGACTCACTATAGGGTGACCATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T7universalprimersite)Up-T6:GGTCACCCTAT
42、AGTGAGTCGTATTCGGAGCTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T6:CTGAGGTTAACCCTCACTAAAGGGAAGCTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T3Promoterprimersite)Up-T7:GGAGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAACCTCAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3gR-T7:CGTGGTATGCTAGTTATTGCTCAGCCTCGACATCCACTCCAAGCTCTTG-3(T7terminatorRprimersite)Up-T8:GTCGAGGCTGAGCAATAACTAGCA
43、TACCACGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3（gR-R为右侧最后一个表达盒反向引物。如1个靶点，Up-T1与gR-R配组；2个靶点，Up-T2与gR-R配组；3个靶点，Up-T3与gR-R配组，.如此类推）gR-R:TAGCTCGAGAGGCGCGCCAATGATACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3(下划线与GAS-R配对)MluI（以上引物对单双子叶植物用Cas9载体通用）为方便操作，参考11页模式预先混合好引物组。注：由Up-T1导入的载体唯一SpeI位点是特别留的一个“后门”。其用途是，当构建好第一组目的靶点gRNA表达盒的载体后，如果情
44、况需要再添加第二组其它靶点gRNA表达盒时（或靶点数目较多，一次连接所有gRNA表达盒不能成功，可以把它们分成2组连接）。可以用SpeI将载体切成线状，再继续用Gibsonassembly将第二组靶点gRNA表达盒克隆进去。第二组靶点gRNA表达盒的扩增需要用gR-R2替代gR-R（Up-T1不变）。也可以利用此位点（或策略I构建载体留的SpeI位点）插入其它目标基因片段。MluIgR-R2:TGTCAACGCGTCCTTTGCTGCCGATTCCAGGTCCATCCACTCCAAGCTCTTG-3(第一组T1-gRNA表达盒使用了LacZ-OsU3启动子)。如果第一组的T1-
45、gRNA表达盒不是用LacZ-OsU3启动子，gR-R2的5端的TGTCAACGCG要替换成如下碱基：OsU3:AAAGATTCCT;OsU6a:CAGGAAAAAA;OsU6b:TGCAAGAACG;OsU6c:CGCTAATGAG（这是各不同启动子的5端10bp，作为连接位点的一部分，见附录序列）。其它Up-T#/gR-T#的使用原理与第一组的相同，但不能重复使用第一组用过的Up-T#/gR-T#（Up-T1可以再使用）。如果是有计划分2组克隆，建议将LacZ-OsU3启动子留在第2组使用，因为第2组克隆的难度大些，可利用LacZ帮助筛选阳性克隆。如果第一组靶点gRNA
46、表达盒是用策略I构建的，第二组靶点gRNA表达盒的克隆就使用SpeI切开载体，使用Up-T1b(ACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGGAATCGGCAGCAAAGG-3)替换Up-T1。gR-R2的序列（及其10碱基替换，如果需要）与以上相同。（2）自制Isothermalinvitrorecombinationreactionmixture：5Xisothermal（ISO）reactionbuffer：25%PEG-8000，500mmol/LTris-HClpH7.5，50mmol/LMgCl2，50mmol/LDTT，4种dNT
48、（3）参考第7页指引设计U3/6启动子排列。但如果是4个靶点，建议把较长的U6c用于T3,U6b用于T4,这样可以用SP2测通T4和T3（见以下步骤7）。（4）在50l反应用20UBsaI酶切2gpYLCRISPR/Cas9-MH(B)约30min。取2l（80ng）电泳检查，确认被切出的ccdB条带（732bp）。655min失活，每管3l（100120ng）约分装冷冻保存。（一般不需要回收纯化，也可使用策略I步骤2电泳回收纯化的样品）。（5）按以上策略I步骤2至步骤6的第一轮PCR同样操作；第二轮PCR使用以上引物对(各引物0.15M)扩增各靶点（T1,T2,
51、等（测序公司可提供，将这些测序引物序列交测序公司确认）从gRNA往启动子方向进行测序，每个引物可以测通2个靶点。A6-targetCRISPR/Cas9constructpreparedbyGibsonassembly附录序列信息(每个PCR扩增序列为活字)：pYLCRISPR/Cas9-MH(B)克隆位点附近关键序列GCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAGCACCGGTAAGGCGCGCCGTAGTGCTCGAGAGACCTCTGAAG(ccdB)GAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGGCGCGCCTCTCGAGCTAGCGGCCGCAT
52、GCATCGATCTCCTACATCGTATAAATTAGCCTATACGAAGTTATTGCATCTATGTCGGGPCR扩增的LacZ-OsU3-gRNA单元序列（767bp,BsaI酶切后737bp）：TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAGGCAGCTATGctggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaag
53、aggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcTAAAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCT
54、TTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGGTTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA(19-20pb靶序列）GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCAAGAGCTTGGAGTGGATGGACCNNNNCGAGACCCACGCTPCR扩增的OsU3-gRNA单元序列(564bp,Bs
55、aI酶切后534bp)TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGACGCGTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCTAATAAAGGAAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGTGATGTGAAGGAGTAAGATA
57、NNNCGAGACCCACGCTPCR扩增的U6a-gRNA单元序列（629bp,BsaI酶切后599bp）：TTCAGAGGTCTCTNNNNCTCTGGAATCGGCAGCAAAGGATTTTTTCCTGTAGTTTTCCCACAACCATTTTTTACCATCCGAATGATAGGATAGGAAAAATATCCAAGTGAACAGTATTCCTATAAAATTCCCGTAAAAAGCCTGCAATCCGAATGAGCCCTGAAGTCTGAACTAGCCGGTCACCTGTACAGGCTATCGAGATGCCATACAAGAGACGGTAGTAGGAACTAGGAAGACGATGGTTGATTCGTCAGGCGAAATCGTCGTCCTGCAGTCGCATCTAT