使用脂质纳米粒在体内输送CRISPR-Cas9可以编辑抗凝血酶基因，从而实现血友病A和B的可持续治疗
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最近，有人提出了不同的治疗策略来治疗抑制剂。Emicizumab是美国食品和药物管理局（FDA）批准的双特异性抗体，已被临床用于治疗抑制剂患者，并涉及旁路策略，以模拟FVIII功能连接FIX和FX的下游凝血途径(5)然而，这种方法要求患者在一生中反复注射。Fitusiran是一种靶向抗凝血酶（AT）的RNA干扰疗法(6)AT是一种内源性凝血酶负调节因子，由serpin家族C成员1编码(SERPINC1)吉恩。使用fitusiran抑制AT被证明是一种有效的旁路方法，可以在不直接表达凝血因子的情况下恢复凝血系统的平衡。这种方法是一个有吸引力和多功能的策略，因为它适用于大多数血友病患者，而不管疾病的原因或抑制剂的发生。然而，这种策略的一个局限性是菲图西兰的短期疗效(6,7)一。
在这项研究中，我们假设CRISPR-Cas9-介导的编辑可能是治疗血友病a和B的一种长期和多功能的治疗选择。我们开发并优化了脂质纳米粒（LNPs），以将Cas9mRNA和一个针对小鼠AT（mAT）的有效引导RNA（sgRNA）传递到小鼠肝脏。接下来，在血友病A和B小鼠模型中评估mAT基因编辑介导的凝血酶生成，以确认所开发系统的治疗效果。在这里，我们证明了使用LNPs在体内递送CRISPR-Cas9可以使AT基因编辑用于血友病A和B的持续治疗。
用于血友病的mAT基因组编辑治疗(图1A)，sgRNA候选目标Serpinc1外显子3是根据最小的靶外风险选择的（图S1A）。11个不含2碱基对错配的sgRNAs用核糖核蛋白（RNP）转染小鼠C2C12细胞系。插入或缺失（indel）频率通过靶向深测序分析。通过初步筛选选择了三个sgRNA（图S1B），在随后的比较试验中，ts4sgrna被证明是最有效的(图1B)C2C12细胞系转染良好，便于sgRNA活性的筛选，但在AT调控的背景下，C2C12细胞与靶细胞的关系并不密切。因此，我们对SG4小鼠的原代RNA进行了一致性检测。因此，在体外研究之后，我们选择ts4sgrna进行进一步的LNP介导的体内研究。
图1选择AT位点作为再平衡的靶基因。
(A)CRISPR-Cas9介导的体内策略Serpinc1（编码）基因编辑。红线和“X”符号表示基因表达或其功能受到抑制。(B)在第二外显子中选择单导rna（sgRNAs）Serpinc1基因和双链断裂的潜力评估后，通过深度测序C2C12细胞与RNP配方。转染和测序分三次进行，每个点表示每个实验的双链断裂频率。TS，目标站点。数据以平均值±SEM表示****P<0.001。
图2制备了CRISPR-Cas9介导的体内基因编辑用LNPs。
(A)使用微流控混合系统的LNP配方示意图。(B)分析了末端修饰和高度修饰的sgRNA在7mm柠檬酸缓冲液中的包封效率（EE）(n=5）。在sgRNA结构中，星号和红色字体表示硫代磷酸酯键和2′-O-甲基核糖核酸。数据以平均值±SEM表示***P<0.001。(C)分析了不同缓冲条件下LNPs的EE、size和PDI。本研究中选择的条件用蓝色表示。(D)通过活体生物发光成像分析生物分布。mFlucLNPs是用卢克mRNA（0.1mpk剂量）静脉注射C57BL/6小鼠。注射3小时后，在活体小鼠及其器官中检测到发光信号。
在微流控混合过程中，添加到缓冲系统中的NaCl量明显影响sgRNA在LNPs中的包封率(图2C)当只处理cas9mrna时，这种影响可以忽略不计；然而，高度修饰的sgRNA需要一定量的离子强度才能被包裹。在优化的条件下（7mM柠檬酸盐和20mMNaCl），共囊化Cas9mRNA和mAT-sgRNA的包封率超过90%，PDI较窄。在这些结果的基础上，我们选择了这种比初始配方具有更好的RNA包封率（>90%）的缓冲条件，以供进一步研究。接下来，通过静脉途径引入含有LNP的荧光素酶来证实LNP的器官特异性传递潜力。值得注意的是，小鼠肝脏表现出高转基因表达，但其他器官没有显示可检测到的荧光素酶表达(图2D)一。
图3.LNPCRISPRmAT诱导mAT表达的长期下调。
(A)使用LNPCRISPRmAT进行体内基因靶向的简要示意图。C57BL6（B6，n=4），B6。FVIII内含子22反转（F8I22I公司,n=每组4个），以及B6。固定敲除（F9穆特,n=每组4只）在本研究中使用小鼠。(B和C)用T7E1基因测序法对各组进行测序，并进行测序。数据显示为平均值±SEM。(D)根据帧移和索引大小（每组3或4个）对索引模式进行分析。每个点表示每个大小索引在总排序结果中的百分比。(E)以B6小鼠为实验对象，用ELISA法筛选AT持续下调(n=每组6个）。用柠檬酸钠包被管从尾静脉采集血液，并对血浆进行mAT-ELISA检测****P<0.0001。(F)测量并比较LNPCRISPRmAT治疗组和对照血友病小鼠组的血mAT浓度。每个点表示单个小鼠的mAT浓度（每组3个或4个）。数据以平均值±扫描电镜表示**P<0.01和***P<0.001；ns，无意义。
由于在肝组织中观察到双链DNA断裂，因此通过评估血mAT浓度来评估mAT功能。当我们每隔2周给药三次LNPCRISPRmAT，我们在这期间用野生型（WT）小鼠反复分析血mAT浓度。随着反复注射LNP-CRISPR-mAT，mAT浓度下降，但在第一次注射LNP-CRISPR-mAT后10周，mAT浓度趋于稳定(图3E)因此，当高度修饰的sgRNA和SpCas9mRNA被包装在LNP中并反复给药时，Serpinc1与对照组小鼠的平均mAT值相比，基因功能下降了70%以上，并且Serpinc1此后10个月内，下调水平保持稳定。虽然对照WT小鼠通过重复取样分析基因表达变化是有用的，但是需要注意的是，对照WT小鼠和血友病小鼠模型的mAT表达可能不同。因此，将LNPCRISPRmAT用F8给小鼠I22I公司和F9穆特并测定血mAT浓度。我们观察到F8的血mAT浓度下降了约40%I22I公司在F9有70%穆特老鼠(图3F)一。
图4体内mAT靶向挽救血栓形成。
图5血栓形成增强可减少自发性出血和继发性血友病并发症。
血友病患者的肾脏损害并不常见(32)但在本研究中观察到肾脏的意外组织学变化。两个F8I22I公司和F9穆特血友病小鼠在鲍曼胶囊中表现出典型的水肿症状(图5B)然而，在对照WT小鼠中没有检测到这些症状。因此，我们也评估了LNPCRISPR垫对肾脏的治疗效果。为此，我们从每只老鼠的肾脏中随机选取三个切片，分析鲍曼胶囊的形状。LNP-CRISPR-mAT治疗减轻了水肿症状，并使F8中的肾小球包膜的总比例降低I22I公司和F9穆特小鼠与对照组小鼠相似(图5B)总之，这些观察结果证实，通过LNPCRISPRmAT治疗的再平衡导致mAT浓度持续降低，从而改善血友病的临床症状。
在活体基因编辑中，最关键的并发症是出现不良的靶向效应。因此，我们首先使用电子显微镜方法选择了七个最高电位的非靶点，这些位点与靶点上的sgRNA序列相差最多3个核苷酸（表S1）。另外，利用双基因组序列进行全基因组检测(33)我们发现了另外三个潜在的位点，这些位点的卵裂分数明显低于靶位点(图6A以及表S1）。接下来，在用LNPCRISPRmAT处理的小鼠肝脏中验证了总共10个不符合目标的候选者。利用来自对照组WT，F8的肝基因组DNA进行靶向深度测序分析I22I公司，和F9穆特(n=3，每个）在两个血友病模型中，在潜在的非靶点没有显示有意义的指标(图6B)一。
(A)TS4SGRNA缺失（粉红色）或存在（蓝色）时体外切割位点的全基因组圆环图。括号内数字：乳沟得分。红色箭头：目标劈开(B)对前7个同源候选（off）和Digenome-seq分析（Di-Offs）检测到的3个候选基因的靶向深度测序结果(n=3）。ND，未检出***P<0.001。(C)每隔2周注射1.2mpkLNPCRISPRmAT三次给WT后的血清AST和ALT浓度(n=6）。(D)血清TNF-β-1或TNF-β-1注射三次后。阳性对照组注射脂多糖20mpk(n=4）。(E)反复注射LNPCRISPRmAT后血清抗SpCas9IgG浓度(n=3）。小鼠静脉注射AAV9-EFS-SpCas9（5×1013vg/kg）也在治疗6周后进行测试。根据ELISA标准曲线计算浓度(R2=0.989）。(F)CD8中IFN-γ表达的典型流式细胞术图+T细胞。IFN-γ在CD8中的表达+重复注射PBS、空LNPs和sgRNA/Cas9mRNA包封的LNP后，评估T细胞(n=3）。详细结果如图S5所示。
LNP-CRISPR的另一个实质性安全问题是免疫反应或炎症。血浆用于天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转移酶（ALT）分析，两组间差异不大。因此，LNPCRISPRmAT给药不会导致肝损伤(图6C)接下来，通过测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）浓度来评估LNP-CRISPR的炎症反应。注射LNP-CRISPR后，炎症细胞因子的产生没有明显增加(图6D)此外，我们用注射LNP的小鼠血清，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）研究了系统性抗Cas9抗体的反应。与LNP空处理相比，反复注射LNPCRISPR-mAT不能诱发抗Cas9免疫球蛋白G（IgG）(图6E)然而，当我们静脉注射AAV-Cas9时，在治疗6周后检测到系统性升高的抗Cas9-IgG(图6E)这表明反复注射LNP-CRISPR比持续AAV介导的Cas9表达相对较少免疫原性。接下来，我们评估了重复给药sgRNA/cas9mrna包封的LNPs是否会诱导对表达Cas9蛋白的细胞的细胞免疫应答。因为细胞免疫反应是由CD8特异性介导的+细胞毒性T淋巴细胞，证实小鼠脾细胞中存在抗Cas9的T细胞(34)通过测定小鼠脾细胞Cas9蛋白攻击后干扰素-γ（IFN-γ）水平。反复注射LNP不能诱导小鼠产生细胞免疫反应(图6F以及图S5）。
在本研究中，我们应用LNPs来运送CRISPR-Cas9。连续三次重复给药LNP处理可抑制F8中AT表达约40%和70%I22I公司和F9穆特分别是老鼠。此外，在两种血友病模型中，抑制水平都伴随着表型恢复。因此，AT抑制的治疗窗可小于50%；然而，需要进一步的研究来详细剖析最低有效调节水平。LNP的优点之一是易于重复给药，由于其具有高度的抗囊免疫反应，不适合于AAV(49)值得注意的是，onpattro，一种FDA批准的LNP-短发夹RNA抑制ATTR可以每3周注射一次(50)一些有效的LNP如C12-200、MC3和cKK-E12已被报道有效地靶向肝脏(51)这些可以通过部分应用可生物降解的脂质来进一步优化(52)同样，我们的原型LNP可以进一步优化颗粒的生物降解性或内体释放，从而有助于开发更具临床相容性的输送工具。
我们在评估用同源性和全基因组检测方法选择的候选基因组位点时，没有观察到任何活动的非靶点。虽然我们使用了双基因组序列，但其他方法，包括循环序列、改变序列和引导序列，也适用于涉及体外或基于细胞的基因组全切以及下一代测序的方法(53)在最近使用CRISPR-Cas9进行的临床项目中，捕捉潜在非目标基因座的有偏和无偏方法的组合已用于IND（研究性新药申请）批准(15,37)因此，利用靶向深度测序结合多次非靶向检测方法的位点特异性验证可以作为验证基因组编辑策略翻译适用性的标准方案。同时，考虑到非目标削减策略，一些工程化的高保真版本的Cas9，如HFCas9、eCas9、HypaCas9和SniperCas9可作为WTSpCas9的替代品(53–55)一。
总之，我们提供了一种新的、基于CRISPR-Cas9的治疗血友病的方法。据我们所知，之前没有报道显示CRISPR-Cas9介导的AT基因编辑非病毒载体和治疗血友病的效果。我们的基因组编辑方法提供了一个多功能的选择来解决各种未满足的需求，这些需求持续存在于主要的先进疗法中，包括基因替代疗法或其他绕道疗法。
小鼠C2C12[美国型培养收集（ATCC）、CRL-1722]细胞或人Jurkat（ATCC，TIB-152）细胞保存在杜尔贝克改良的基本培养基中，该培养基补充有4mM谷氨酰胺（4.5g/L）、1mM丙酮酸钠、10%胎牛血清、青霉素（100U/ml）和链霉素（100mg/ml）。对于最初的sgRNA筛选，编码人类优化的SpCas9和sgRNA或RNP复合物的质粒由4μgCas9和1μgsgRNA形成，使用10μl的tips在1150V下对氖气转染（LifeTechnologies，CarlsbadCA，USA）施加15ms和两个脉冲。作为附加对照试验，小鼠原代肝细胞（4×10）5细胞）用1μgLNP处理三个选定的sgRNAs（TS2、TS4和TS11）。转染3天后，收集细胞，用DNeasy血液和组织试剂盒（德国Hilden，Qiagen）提取基因组DNA，进行靶向深度测序，测量indel频率。
LNP采用NanoAssembler台式仪器（加拿大温哥华市精密纳米系统公司）按照先前描述的方法制备(26)将脂质组分（26.5:20:52:1.5摩尔比的电离脂质、兴奋剂、胆固醇和PEG脂质）溶解在乙醇中，RNAs（Cas9mRNA/sgRNA重量比为1:1）溶解在10mM柠檬酸缓冲液（pH3）中。最终可电离脂质与RNA的重量比为10:1，最终体积比为1:3。然后，以12ml/min的流速通过微流控混合制备的溶液来制备LNPs。使用3500分子量截止透析盒（LifeTechnologies）对1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）透析16小时，以交换缓冲液。为了对制备的LNPs进行表征，采用动态光散射法确定了LNPs的尺寸、PDI和zeta电位。采用定量核糖绿分析法（Life-Technologies）测定rna的包封效率。
C57BL/6小鼠体重为18~20g，从OrientBio（韩国京畿道首尔）购买。小鼠静脉注射萤火虫荧光素酶mRNA的LNPs（剂量为0.1mpk）。三小时后，小鼠被注射d-荧光素腹腔注射并孵育15分钟。使用IVIS（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市PerkinElmer）进行全身和体外器官的生物发光成像。所有动物研究程序均由EWA女子大学机构动物护理和使用委员会（机构动物护理和使用委员会19-022）批准。
C57BL/6（B6）小鼠购自Koatech（韩国京畿道平台）。B6。FVIII内含子22反转（F8I22I公司)还有B6。固定敲除（F9穆特)由基于CRISPR-Cas9的基因编辑生成（图S7）(56).对7至9周龄雄性小鼠进行进一步的实验。将B6和每只血友病小鼠随机分为两组，其中半数分别注射LNP包装的spcas9mrna和高度修饰的sgRNA（LNP-crisprmat）3次，间隔2周。通过将1.2mpkLNPCRISPR垫和高达600μl的温生理盐水混合制备注射溶液，并通过静脉途径注射。600μl注射液不能诱导肝内的水动力基因传递（图S8）。B6小鼠经尾静脉重复采血18周。血友病小鼠在第一次注射LNP-CRISPR-mAT后8周被安乐死。从下腔静脉采集新鲜血液450μl，与50μl3.2%柠檬酸钠混合，离心后收集上清液制备血浆。采血后不经灌注采集各器官，部分组织用福尔马林固定，剩余部分用于基因组DNA提取。本研究由首尔国立大学动物护理和使用委员会（SNU-200715-2）批准，并根据批准的指南进行。
用G-DEX-IIc基因组DNA提取试剂盒（韩国京畿道内含子生物技术）从器官组织中提取基因组DNA。设计引物用于扩增LNPCRISPRmAT靶向基因组区域。接下来，在T7E1分析中，聚合酶链反应（PCR）扩增产物进行异源双链杂交和T7E1内切酶（美国马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室）培养30分钟。凝胶电泳中剪切带的存在被认为是indel形成。对于靶向深度测序，从转染细胞或注射LNP的组织中提取基因组DNA，通过PCR扩增出感兴趣的基因组区域。在随后的PCR过程中，使用IlluminaTrueSeq适配器对产生的扩增子进行条形码编码。用PCR纯化试剂盒（韩国首尔Geneall）对产物进行纯化，然后以等摩尔比混合。使用IlluminaMiseqv2（PE150）（美国加利福尼亚州圣地亚哥市Illumina）对最终的库进行配对末端测序。用Cas分析仪对Indel频率进行定量分析(www.rgenome。网)原间隔区相邻基序序列上游3-bp区域的Indels被认为是Cas9引起的突变。
使用mAT-IIIELISA试剂盒（英国剑桥Abcam）用ELISA法测定血液浓度。根据制造商的说明使用血浆进行酶联免疫吸附试验。在450nm处用分光光度计（瑞士苏黎世Tecan）测量吸光度，并通过将测量的光密度值应用于标准曲线来计算浓度。AST和ALT用AST/ALT活性测定试剂盒（美国德克萨斯州休斯顿市Apexbio）测定。血浆分别用1:9和1:3稀释，用于AST和ALT分析。AST/ALT测定按照制造商的说明进行。用分光光度计（瑞士苏黎世Tecan）分别在450和570nm处测量吸光度，用于AST和ALT分析。为了分析炎性细胞因子的产生，WT小鼠每隔7天向尾静脉注射1.2mpk的LNP或LNPCRISPRmAT三次。最后注射后24小时内，从前腔静脉采血，用ELISA法测定血清TNF-α和IL-1β浓度（bios，Woburn，MA，USA）。
使用技术凝血酶TGA试剂盒（美国俄亥俄州西切斯特市，Shifarma）测量凝血酶生成。简言之，将40μl血浆稀释液、10μl试剂C低缓冲液和50μl底物的混合物添加到单孔中，并以1分钟的间隔测量360/450nm处的荧光（激发/发射）120min。使用Cytation5在96孔板中进行凝血酶生成的荧光测量（BioTek，Winooski，VT，USA）。使用制造商提供的软件计算凝血酶生成曲线。
潜在的偏离目标的地点首先是使用一个电子工具，即offfinder(www.rgenome。网)含有高达3-bp错配的小鼠基因组位点被认为是非靶点，并通过靶向深度测序进一步证实。通过Digenome-seq获得额外的目标外候选(33).简而言之，在适当的缓冲液[100mMNaCl，50mMtrisHCl，10mMMgCl]中，用SpCas9（300nM）和sgRNA（900nM）体外切割人类基因组DNA（8μg）2和牛血清白蛋白（100μg/ml）]，纯化消化后的DNA，并使用Covaris系统（LifeTechnologies）和末端修复混合物（ThermoFisherScientific，Waltham，MA，USA）生成初始文库。DNA片段的末端与适配器连接，最后的文库通过IlluminaHiSeqXTen测序仪（美国加利福尼亚州圣地亚哥市Illumina）通过WGS（全基因组测序）进行测序。将测序结果映射到小鼠基因组参考GRCm38后，使用Digenome-seq工具分析产生的BAM文件(www.rgenome。网)将卵裂得分大于2.5的基因座作为潜在的非靶位点，并通过靶向深度测序进一步验证。表S1和S2分别列出了非目标候选的靶位点和引物信息。
给小鼠注射三次空的LNP、sgRNA/Cas9mRNA-封装的LNP和PBS。最后一次注射后24小时，从小鼠脾脏制备单细胞悬浮液。电池（1×106)分别与2.5μg重组Cas9（Cas9）或phorbol12肉豆蔻酸13醋酸盐（PMA）（50ng/ml）和离子霉素（1μg/ml）单独培养18小时。为了测量产生IFN-γ的细胞，用brefeldinA（eBioscienceInc.，SanDiego，CA，USA）进一步处理脾细胞5小时。用含0.5%的荧光标记物进行细胞分选。使用CytoFLEXS流式细胞仪（BeckmanCoulter，Brea，CA，USA）获取染色细胞，并使用FlowJo软件（TreeStarInc.，Ashland，OR，USA）进行分析。使用的抗体是抗原呈递细胞（APC）/Cy7抗小鼠CD3（BioLegend，SanDiego，CA，USA，100706）、异硫氰酸荧光素（FITC）抗小鼠CD8（BioLegend，100222）和藻红蛋白（PE）抗小鼠干扰素-γ（BioLegend，505808）。
ELISA法检测抗Cas9抗体反应。简单地说，在37℃下用0.1μg每孔SpCas9蛋白（Aldevron，9212）包被96孔板3小时。随后，将平板清洗四次，然后通过添加100μl分析稀释液缓冲液（BioLegend，421203）在25℃下封闭1小时。将注射有LNPCRISPRmAT或AAV9-Cas9的小鼠血清稀释40倍，将培养皿与样品在25℃下培养2小时。洗涤后，用抗小鼠IgG-结合辣根过氧化物酶（HRP；Sigma，A9044；Sigma-Aldrich）培养皿，随后洗涤，然后用三甲基硼（TMB）底物（BioLegend，421101）处理。在使用停止溶液（BioLegend，423001）停止HRP/TMB反应后，在450nm处进行吸光度测量。用市售小鼠抗Cas9抗体（Abcam，191468）作标准曲线试验，并与标准曲线进行比较(R2=0.989）用于测定受试样品的抗Cas9IgG浓度。