GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程ProtocolNo.PT140726-1ProtocolNo.PT140726-11，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：pGK1.1U6CACCGCAAA455’-5’3’-3’--～20bp2，操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A．单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。
B．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。
1.设计OligoDNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPRDesign：/●德国癌症研究中心的E-Crisp：/E-CRISP/designcrispr下面我们选择麻省理工学院的CRISPRDesign工具来做设计举例，以Fut8基因为例，一次只能输入大小为23～250bp的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免Guide序列跨内含子的。
点击“Downloadasgenbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”根据左边的score的高低选取合适的Guide序列，以Guide#1序列为例，2条单链oligo的序列如下（红色字体部分是要与BbsI酶切后的载体相互补的部分）：Fut8-F:caccGAATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R:aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意：oligoDNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。
另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续PCR或测序检测阳性克隆，引物能扩增约300bp的DNA片段，上游引物距突变位点约100bp，下游引物距突变位点约200bp。
将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。
2.T4DNALigase连接将合成后的2条单链oligoDNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1linearvector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4DNALigase连接反应，pGK1.1载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。
ProtocolNo.PT140726-1ProtocolNo.PT140726-1退火反应体系如下：将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。
取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4DNALigase连接反应，反应体系如下：pGK1.1linearvector2μl双链DNA1.75μlT4DNALigase1μl10xT4DNALigaseBuffer1μlddH2O4.25μl10μl※注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo序列和负链Oligo序列，合成后的2条单链oligoDNA退火复性成双链DNA，再进行T4DNALigase连接反应。
连接产物可以直接转化DH5a高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。
3.电转染靶细胞(推荐)转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg/μl浓度，再取4～7μg进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。
另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。
4.混合克隆pool检测48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞冻存。
PCR检测（以Fut8基因为例）：11步骤所制备的模板5ulFut8-seq-F(10mM):1ulFut8-seq-R(10mM):1uldNTPMixture(10mMeach):1ulTaq酶：0.5ul10XTaq酶buffer：5ulMgcl23ulH2O:33.5ulTotal50ul程序：95℃2mincycles1x95℃20SX℃20S72℃30S72℃5mincycles1x95℃变性5minPCR产物使用CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。
正链Oligo(100μM)0.5μl负链Oligo(100μM)0.5μlddH2O18μlAnnealingBuffer(20x)1μl20μl}cycles35x上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。
5.CruiserTM筛选阳性克隆将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用CellPlaza(Cat.No.:GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用GenlociTNA抽提试剂盒(Cat.No.:GL10851S)。
然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用GenlociCruiserTM突变检测试剂盒(Cat.Nos.:GCMD025,GCMD100)，对CruiserTM筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。
在设计Guide序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G，需要自行加上一个G，因为这个G对于起始转录非常重要。
Q-2：转染效率低，怎么办？A-2：因为Cas9蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。
所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。
Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer，所以不推荐使用；Life的Neon系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而Genloci的CTX-1500A电转仪，转化效率高，不需要单独配制buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。
Q-3：单个细胞不生长，怎么办？A-3：对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。
共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用CellPlazaTM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。
如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。
具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。
Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？A-4：建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。
目前市面上主要有三种错配酶：CruiserTM酶、T7EI和Surveyor酶。
其中，CruiserTM酶和Surveyor酶属于CelI家族，这两种酶的筛选特异性比T7EI高。
在酶切筛选过程中，T7E1的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐CruiserTM酶，它特异性高且价格合理。
ProtocolNo.PT140726-1ProtocolNo.PT140726-1VI．附录附录ApGK1.1linearVector以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。
Figure3.pGK1.1插入位点图示Figure4.pGK1.1质粒图谱pGK1.1：ProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.VIICruiserTM操作说明1，操作步骤1）基因组DNA的准备提取细胞的基因组DNA，推荐使用Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒（Cat.No.:GL10851S），只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA，详细实验步骤请参看GenlociTNA抽提试剂盒（Cat.No.:GL10851S）说明书。
2）杂交DNA的准备a)第一轮和第二轮（巢式）PCR引物设计分别设计FirstPrimers和NestedPrimers。
其中FirstPrimers要求具有较高的特异性，其扩增产物推荐为500～1000bp，NestedPrimers推荐扩增产物长度为300～600bp。
FirstPrimers和NestedPrimers引物对应目的序列的位置如下：模板DNA第一轮PCR产物第二轮（巢式）b)第一轮PCR：获得目的片段将已经提取的基因组作为模板，使用FirstPrimers，以高保真DNA聚合酶扩增获得目的片段，要求目的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。
同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。
推荐扩增循环数35～40cycles，反应体系25μl，100ng≤模板量≤300ng。
PCR完成后，取7～8μl进行电泳检测。
c)第二轮（巢式）PCR：获得杂交DNA根据第一轮PCR电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照Marker的亮度估算产物中DNA的浓度，稀释至总核酸浓度为10～20ng/μl，一般需要稀释10～50倍）。
其中野生型模板扩增产物标记为：WTDNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MTDNA；根据您的检测样本量的大小取合适量的稀释产物作为第二轮PCR的模板。
GNestDNApolymerase置于-20℃保存，且避免操作污染。
在60s内，GNestDNApolymerase可扩增1kb的DNA片段。
PCR反应程序推荐如下：ProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.ProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.94℃45s94℃10sTm*10s72℃#15-30s72℃45s95℃3min自然冷却40℃以下10min35cycles*Tm值由NestedPrimer决定，一般为55℃左右。
#产物片段长度≤500bp时，建议为72℃，15s；产物片段长度＞500bp时，建议为72℃，30s。
扩增结束后，取2μlPCR产物（实验组）用于下一步CruiserTM酶切检测。
酶切体系如下：3.将实验组和对照组置于PCR仪中45℃孵育15～20min。
经CruiserTM核酸酶切割后形成三个明显片段，分试剂盒中PositiveControlDNA为杂交后的DNA片段，别为393bp、134bp、259bp，其中134bp和259bp片段是酶切后片段，而393bp片段为杂交形成的homo-duplexDNA片段，无酶切割位点，因此，片段大小不变。
Figure2阳性对照的电泳结果M：100bp-DNAMarkerCK+：PositiveControlDNA※注意：酶切验证阳性的克隆，若需要进行测序，需以第一轮PCR产物为模板，使用相应的高保真DNA聚合酶、NestedPrimer引物进行扩增，回收片段送测序即可。
该情况常见于cellpool检测中，因cellpool中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低，导致获得DNA片段中杂交DNA含量过少，此时建议设立2-3个重复分别进行PCR检测，只要检测到CruiserTM酶切条带，则可认为敲除成功，存在阳性克隆。
c．CruiserTM核酸酶失活。
使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。
Q-2：电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？A-2：出现该情况表明制备的DNA片段中含有其他杂交位点。
首先，应确认制备的DNA片段是否存在其他DNA的污染；其次，根据酶切结果进行判定：若酶切后形成的各条带单一，可能在DNA片段上含有其他杂交位点，需通过DNA测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是DNA片段扩增中，DNA聚合酶错配扩增导致，使用高保真DNA聚合酶重新进行扩增可消除影响。
如果PCR反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，建议调整PCR反应条件，以保证只有特异性扩增的PCR产物用于突变检测。
Q-4：CruiserTMEnzyme检测结果是否会出现假阳性？A-4：CruiserTMEnzyme是通过基因工程生产的CelI同源核酸内切酶，具有更好的稳定性、高度的特异性和高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源DNA双链。
目前为止，尚未有文献报道使用CruiserTMEnzyme或CelI会出现假阳性，或出现其他核酸酶活性。
Q-5：电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？A-5：因为杂交的DNA片段是通过巢式PCR得到的，所以特异性没有任何问题。
在得到与预期一致的酶切条带后，不能100%判断该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。
因此，需要进行PCR片段的TA克隆和测序验证。
VII．附录附录A阳性对照说明等量野生型和突变型DNA片段混合，经98℃加热、自然冷却后形成的杂交DNA，该DNA链存在两处突变，均为单碱基突变，突变点间距2bp，如下图所示。
经CruiserTM核酸酶切割后形成三个明显片段，分别259bp，其中134bp、259bp为酶切形成的片段，393bp为杂交形成的homo-duplexDNA片段，134bp、为393bp、无酶切割位点，因此，片段大小不变。
阳性对照推荐用量：10μl体系用量200ng。
附录B目的DNA制备说明提取基因组DNA后，在设计FirstPrimers用于第一轮PCR时，要求其具有较高的特异性，其扩增产物推荐为500～1000bp，NestedPrimer推荐扩增产物长度为300～600bp。
在设计NestedPrimer时，应使突变位点位于片段的1/3～2/3处，且反应后获得的片段大小不应小于100bp，以尽可能增强酶切结果的可观察性。
例如：使用第二轮（巢时）PCR扩增获得全长为400bp的DNA片段，通过调整引物位置，使得预计的突变位点位于距5’-端140bp处，则CruiserTM核酸酶酶切后获得片段应为140bp、260bp。
若以1.5%～2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得3条清晰的片段，大小分别为140bp、260bp、400bp。
VIII.参考文献1.YangB,WenX,KodaliNS,OleykowskiCA,MillerCG,Ku-linskiJ,BesackD,YeungJA,KowalskiD,YeungAT.Purification,cloning,andcharacterizationoftheCELInuclease.Bio-chemistry,2000,39:3533～3541.2.PerryJA,WangTL,WelhamTJ,GardnerS,PikeJM,YoshidaS,ParniskeM.ATILLINGreversegeneticstoolandaaccessiblecollectionofmutantsofthelegumeLotusjaponicus.PlantPhysiology,2003,131:866～871.3.McCallumCM,ComaiL,GreeneEA,HenikoffS.TargetingInducedLocalLesionsINGenomes(TILLING)forPlantFunctionalGenomics.PlantPhysiology,2000,123:439～442.4.OleykowskiCA,MullinsCRB,GodwinAKYeungAT.Mutationdetectionusinganovelplantendonuclease.NucleicAcidsResearch,1998,26:4597～4602.5.WienholdsE,EedenFV,KostersM,MuddeJ,PlasterkRHA,CuppenE.Efficienttarget-selectedmutagenesisinZebrafish.GenomeResearch,2003,13:2700～2707.6.TillBJ,BurtnerC,ComaiL,HenikoffS.Mismatchcleavagebysingle-strandspecificnucleases.NucleicAcidsResearch,2004,32:2632～2641.。