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2024.08.27广东
图1.基因转录示意图[2]
●技术应用
1.初步判断所研究的课题是否涉及表观遗传调控机制
2.结合基序分析，识别参与基因调控的转录因子
3.与超级增强子鉴定联合分析，明确活性超级增强子的范围
4.更好地了解药物或疾病的基因调控和细胞应答机制
二、复旦大学团队首次实现了开放染色质区域转录蛋白机器的鉴定及功能研究—ATAC-MS
复旦大学贺福初/丁琛团队于2021年在《SCIENCEADVANCES》上发表题为“Proteome-wideprofilingoftranscriptionalmachineryonaccessiblechromatinwithbiotinylatedtransposons”的研究论文[4]，该研究成果首次实现了开放染色质区域转录调控蛋白机器的鉴定及功能研究，为基因转录调控研究提供了强大的技术支撑。
研究团队基于ATAC-seq技术开发了一种直接富集和定量鉴定内源性开放染色质区域实时原位转录的转录调控蛋白机器的新技术“ATAC-MS”（AssayforTransposase-AccessibleChromatinusingMassSpectrum）。
通过ATAC-MS描绘四种细胞系中转录调控网络，结果表明ATAC-MS可直接鉴定开放染色质区域结合蛋白的优势。且ATAC-MS在使用5×105细胞量时，即可检测到高丰度的转录因子/转录辅助因子。
图5.ATAC-MS对TF/TC的检测灵敏度
通过肿瘤坏死因子（TNF-α）处理Hela细胞后，利用ATAC-MS成功鉴定到关键TF家族（如NF-κB、JUN）及其相互作用的TF的动态变化。其中ATAC-MS和ATAC-seq鉴定的TF的关联分析，进一步验证NF-κB通路的激活。
图6.NF-κB信号通路激活过程，显示TF/TC的变化趋势
研究团队进一步将ATAC-MS与强阴离子交换技术结合，开发出高分辨率的fATAC-MS（ATAC-MScoupledwithSAXfractionation），该技术通过盐溶液梯度洗脱DNA-转录蛋白复合物，绘制出更高分辨率的DNA-转录调控复合物图谱。研究结果显示，该技术能识别不同组分中的关键调控因子及其DNA结合模式，验证了其在全基因组范围内解析DNA-蛋白质互作关系的潜力。
图8.fATAC-MS流程
此外，研究团队还将ATAC-MS与CRISPR/Cas9技术进行结合，开发了具有靶向性的ctATAC-MS（dCas9-targetedATAC-MS），设计并表达了一种新Tn5-dCas9融合蛋白，既具有Tn5转座酶结合开放染色质的功能，检测基因组水平的转录调控复合物，又可在sgRNA的引导下对特定的DNA序列具有亲和力，精准鉴定特定位点的转录调控复合物。ctATAC-MS系统地描述了在小鼠肝脏昼夜节律模型中靶向E-box的转录过程，揭示了不同TFs在昼夜节律中的潜在机制。
图9.ctATAC-MS的技术原理
1.结合ATAC-seq分析，识别细胞特异性的转录调控网络
2.研究转录因子和共调节因子结合到开放染色质区域的动态变化
3.通过质谱对结合在开放染色质区域上的转录蛋白复合物进行鉴定和定量
4.fATAC-MS提供高分辨率的染色质-转录蛋白图谱
5.ctATAC-MS精准定位特定开放染色质区域的转录机制
●技术优势
1.与ATAC-seq联合分析，全面解析DNA-转录蛋白机制
2.可直接鉴定转录蛋白复合物
3.对低丰度的转录因子具有高灵敏度
4.同时获取开放染色质的基因组位置、DNA结合蛋白和转录复合位点的相互作用信息
三、清华大学团队开发了检测染色质结合凝聚体的技术—ACC-seq
清华大学李寅青/李丕龙团队于2024年4月16日在《Cell》上发表题为“Dual-RoleTranscriptionFactorsStabilizeIntermediateExpressionLevels”的研究论文[5]，研究团队开发了一种可在全基因组范围内检测染色质结合凝聚体的技术—ACC-seq（AssayforChromatin-boundCondensatesbyexploratorySequencing），并利用该工具揭示了一类具有相分离能力的双重作用转录因子（dual-actionTFs）。它们能抑制基因高表达的同时激活沉默基因，通过形成凝聚体调节基因表达的中间水平。
图10.ACC-seq研究成果总概
ACC-seq是利用Tn5转座酶在不同凝聚体调节条件下对DNA片段的可及性差异来识别凝聚体占位区域。三个核心步骤为使用不同的处理方式调节染色质凝聚体状态：
对这三种不同处理方式处理的样本分别使用Tn5转座酶进行切割。由于凝聚体会阻碍Tn5转座酶对DNA的切割，因此再凝聚体占位区域，Fix样本的DNA可及性会降低，而1,6-HexFix样本的DNA可及性会恢复。最后对切割后的DNA片段进行高通量测序。
图11.ACC-seq技术原理
利用ACC-seq验证了FUS(IDR)-SOX2的DNA结合域融合的蛋白在形成凝聚体中的功能，并通过FRAP（光漂白荧光恢复技术）呈现这些凝聚体的动态特性。
研究团队运用ACC-seq在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中鉴定出一类具有相分离能力的转录因子，即凝聚体形成的双重作用转录因子（condensate-formingdual-actionTFs），当这些dual-actionTFs发生相分离时，与转录的不同组分具有显著差异的亲和性，这种差异性亲和性驱使dual-actionTFs在调控基因表达水平上具有激活和抑制的双重功能，抑制基因高表达的同时激活沉默基因，有效地将基因表达水平调节到一个中间水平。
图12.基因表达调控实验示意图
研究团队进一步研究，明确了dual-actionTFs的双重作用与其相分离能力有关，dual-actionTFs的内在无序区域（IDR）包含多个功能序列单元，能够独立发挥激活或抑制作用。ETV5是唯一在IDR中同时含有激活和抑制单元的转录因子。破坏IDR会导致dual-actionTFs在凝聚体中与MED1的亲和性改变，并失去双重作用。而将dual-actionTFs与亲水的MBP肽段融合，使这些蛋白的相分离能力受到干扰，双效转录调控功能也会受到显著影响。
图13.dual-actionTFs通过差异分子间相互作用的凝聚体形成结构域发挥稳定的中级转录调控作用的模型
四、多种技术比对
图14.多种技术对比[6,7]（仅供参考）
图15.开放染色质经典检测技术对比[8]
五、技术应用
1.应用方向一：基因调控（ATAC-seqATAC-MS）
ATAC-seq可指导ATAC-MS，找到感兴趣的开放染色质区域，ATAC-MS则可验证ATAC-seq预测的转录因子，并进一步描绘转录调控蛋白复合物的组成。ATAC-seq和ATAC-MS整合分析可在全基因组范围描绘出转录调控复合物图谱，包括转录因子结合位点，以及这些转录因子是如何组装成转录调控复合物的（图3、图6），包括能够可构建详细的转录网络图，揭示在细胞过程中不同转录因子和共调控因子如何相互作用和共同发挥功能。深入解析不同层次的转录调控机制。
另外开发的fATAC-MS可以对开放染色质进行分级分析，获得不用层次的转录调控复合物信息，通过fATAC-MS将开放染色质区域细分，再结合ATAC-seq，可以描绘出更高分辨率的转录调控复合物图谱。
此外，ctATAC-MS可以针对感兴趣的特定基因组区域进行精准分析。与ATAC-seq结合，ctATAC-MS可以深入探究特定基因或调控元件周围的转录调控复合物组成和动态变化。
（1）研究案例
图16.ATAC-MS和ATAC-seq结果的整合揭示了E2或4-HT处理后的转录机制
研究团队将开发的ATAC-MS应用于C2C12细胞分化过程中的转录调控机制的研究，结合ATAC-seq、ChIP-seq等方法的验证，揭示了RFX1（调控因子X1）可调节C2C12细胞的增殖和分化。
图17.ATAC-MS和ATAC-seq结果的整合揭示了C2C12成肌细胞分化过程中的转录机制
（2）研究思路
2.应用方向二：相分离（ACC-seqATAC-MS）
ACC-seq协同ATAC-MS进行应用，ACC-seq识别染色质结合凝聚体的区域，而ATAC-MS可以鉴定凝聚体中的蛋白质成分，并筛选出潜在的凝聚体形成转录因子；利用ACC-seq识别受凝聚体形成TF调控的基因，并分析其表达水平的变化，
然后利用ATAC-MS鉴定与这些TF相互作用的蛋白，包括共激活因子和共抑制因子，结合qPCR、WB等实验方法，验证这些TF的双重功能和差异相互作用；还可以利用ACC-seq和ATAC-MS分析不同细胞类型、发育阶段或疾病状态下凝聚体形成TF的结合和表达变化，结合基因敲除、过表达等实验方法，研究这些TF对细胞命运、发育或疾病进程的影响。总之，通过比较ACC-seq和ATAC-MS在不同条件下的结果，可以研究凝聚体的动态变化及其对转录机器的影响。
同样基于ATAC-seq开发的新工具ACC-seq，具有一定的应用潜力。这个研究成果“Dual-RoleTranscriptionFactorsStabilizeIntermediateExpressionLevels”[5]利用开发的ACC-seq比较ATAC-seq在Native、Fix和1,6-HexFix条件下的染色质可及性模式，推断染色质结合凝聚体的存在。特别是在1,6-HexFix条件下，ACC-seq能够恢复DNA可及性，从而生成高水平的可扩增ATAC-seq片段。
图19.ACC-seq与RNA-seq、GRO-seq对比的IGV峰图
3.应用方向三：表观基因组（ATAC-seqCUT&Tag）
CUT&Tag，即靶向剪切及转座酶技术，利用酶锚定技术绘制蛋白质-DNA互作图谱，和ChIP-seq一样使用抗体特异性结合目的蛋白，但不需要甲醛交联和免疫共沉淀，因而所需细胞量少，信比高。利用ATAC-seq识别全基因组范围内的开放染色质区域，然后通过CUT&Tag分析目标蛋白（如特定转录因子或带有特定修饰的组蛋白）在基因组中的结合位点，整合两种数据，筛选出目标蛋白特异性结合的开放染色质区域，这些区域可能具有重要的转录调控功能；可以揭示开放染色质区域的表观遗传特征（如特定修饰的富集模式，以及其与基因表达的关系）；也可以利用ATAC-seq和CUT&Tag分析不同细胞类型或疾病状态下开放染色质区域和目标蛋白结合的变化，通过差异分析揭示关键的转录因子和表观遗传修饰。
2024年7月15日，北京协和医院赵玉沛/由磊团队在《CancerLetters》杂志上发表了题为“Histonelactylationdynamics:Unlockingthetriadofmetabolism,epigenetics,andimmuneregulationinmetastaticcascadeofpancreaticcancer”的研究论文[9]。这项研究通过scRNA-seq、ATAC-seq和CUT&Tag等多组学技术研究了组蛋白乳酸化在胰腺癌转移过程中对代谢-表观遗传-免疫调节的影响，发现LDHA-H4K12la免疫基因轴在代谢、表观遗传学和免疫之间建立了新的调控节点，揭示了组蛋白乳酸化与免疫逃逸和肿瘤进展之间的关系，强调了其作为潜在治疗靶点的重要性。
研究使用CUT&Tag检测组蛋白修饰，分析LDHi（LDHA抑制剂）处理前后H4K12la富集的变化，发现H4K12la的表达显著减少，主要集中在启动子区域，
图22.LDHi处理前后H4K12la富集的变化
考虑到组蛋白乳酸化对核小体构型和染色质可及性的未知影响，研究团队又利用ATAC-seq分析LDHi处理前后胰腺癌细胞中开放染色质区域的变化，结果显示LDHi导致开放染色质区域密度降低，同样是主要集中在启动子区域。
图23.I）CUT&Tag和ATAC-seq检测结果在基因功能元件上的分布；J）Peaks的元基因图谱和TSS热图表明，H4K12la和ATAC主要靶向启动子
图24.G-H）ATAC-seq和H4K12laCUT&Tag的peaks的GO富集分析；K-L）对启动子可及或富集H4K12la的PBS特定motifs进行鉴定和功能富集分析
应用场景方向：
六、总结
参考文献
1.KlemmSL,ShiponyZ,GreenleafWJ.Chromatinaccessibilityandtheregulatoryepigenome.NatRevGenet.2019;20(4):207-220.
2.ZhangL,WangS,WangW,etal.Phase-SeparatedSubcellularCompartmentationandRelatedHumanDiseases.IntJMolSci.2022;23(10):5491.Published2022May14.
3.BuenrostroJD,GiresiPG,ZabaLC,ChangHY,GreenleafWJ.Transpositionofnativechromatinforfastandsensitiveepigenomicprofilingofopenchromatin,DNA-bindingproteinsandnucleosomeposition.NatMethods.2013;10(12):1213-1218.
4.ZhangH,QinZ,YueX,etal.Proteome-wideprofilingoftranscriptionalmachineryonaccessiblechromatinwithbiotinylatedtransposons.SciAdv.2021;7(43):eabh1022.
5.HeJ,HuoX,PeiG,etal.Dual-roletranscriptionfactorsstabilizeintermediateexpressionlevels.Cell.2024;187(11):2746-2766.e25.
6.GrandiFC,ModiH,KampmanL,CorcesMR.ChromatinaccessibilityprofilingbyATAC-seq.NatProtoc.2022;17(6):1518-1552.
7.SunY,MiaoN,SunT.DetectaccessiblechromatinusingATAC-sequencing,fromprincipletoapplications.Hereditas.2019;156:29.
8.KleinDC,HainerSJ.GenomicmethodsinprofilingDNAaccessibilityandfactorlocalization.ChromosomeRes.2020;28(1):69-85.
9.WangX,LiuX,XiaoR,etal.Histonelactylationdynamics:Unlockingthetriadofmetabolism,epigenetics,andimmuneregulationinmetastaticcascadeofpancreaticcancer.CancerLett.2024;598:217117.