医学真菌学检查是诊断真菌病的重要依据，随着真菌感染病例的日益增多，对实验室的诊断也提出了更高的要求。不论是患者浅部或深部感染诊断，几乎全依赖于临床标本的真菌学检查。特别是系统性真菌感染，其早期特异的诊断方法是挽救患者生命的关键，而病原真菌的形态结构十分多样，在不同条件下同一真菌也可有不同特点的形态。因此，在真菌的实验室检查中，必须熟练掌握各类真菌的形态特征以及在不同条件下的演变规律，才能获得对致病真菌正确的诊断。目前真菌感染的实验室检查方法主要包括常规检查法和特殊检查法两类。常规检查法主要包括：①形态学检查(直接镜检+染色镜检)。②培养检查。③组织病理学检查。特殊检查主要包括：①血清学方法。②分子生物学方法。
一、进行真菌实验室诊断的注意事项
二、分离及鉴定真菌的培养基
(一)配制培养基的一般原则
①各成分混匀后以文火缓慢加热，并不断搅拌，煮沸1min，过热会破坏有效成分。②分装试管应在高压灭菌前，而分装平皿应在高压灭菌后。③高压灭菌一般在118～121磅，10～15min。④需加血液或不能高压的成分如抗生素，应在培养基冷却至50左右时加入混匀。⑤试管分装量约7~8ml，平皿约15ml，如需培养4～6周，平皿内应有35～40ml的量。培养基中抗生素的浓度和添加方法：氯霉素、庆大霉素和放线菌酮能耐热，可在培养基高压灭菌前加入，其他抗生素均在培养基高压灭菌后冷却至45℃～50℃时加入。青霉素20～100μg/ml，链霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放线菌酮500μg/ml，庆大霉素5μg/ml。
(二)分离和鉴定真菌的培养基
各种医学真菌所用培养基的成分，又可根据不同要求，分成分离、富集、选择、特性研究等含不同成分培养基，具体见表。
表分离鉴定真菌培养基分类表
培养基种类分离用培养基
使用目的
1.Brainheartinfusionagar分离腐生性及病原性真菌
2.Brainheartinfusionagarwithantibiotics分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
3.BrainheartinfusionbiphasicbloodCulturebottles从血液中分离真菌
4.Dermatophytetestmedium分离皮肤丝状菌，建议仅做筛检用
5.Inhibitorymoldagar分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
6.Mycoselormycobioticagar分离皮肤丝状菌
7.Ssbourauddextroseagar分离腐生性及病原性真菌
8.Yeastestractphosphateagar分离除了皮肤丝状真菌以外的真菌
区分试验培养基
1.Ascosporeagar检测产子囊孢子酵母菌
2.CornmealagarwithTween80andtrypanblue检测产厚膜孢子酵母菌
3.Cottonseedconversionagar使双相型真菌由霉菌型转变为酵母型
4.Czapek’sagar分离及区分Aspergillusspp
5.Nigerseedagar鉴定Cryptococcusneoformans
6.Nitratereductionmedium检测Cryptococcusspp.还原nitrate能力
7.Potatodextroseagar证实Trichophytonrubrumm产色素能力制作载玻片培养技术
8.Yeastfermentationbroth测定酵母菌的发酵能力
9.Yeastnitrogenbaseagar测定酵母菌的糖类同化能力
三、临床样本的采集与处理
(一)皮屑边缘、疱壁、脓液、深层趾(指)间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同时种于沙氏琼脂加氯霉素2管，置25℃培养2周。
(二)甲屑用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，标本用酒精浸泡待干燥后种于沙氏(SDA)培养4周，并同时作KOH涂片。
(三)毛发取病发(变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除)15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检，5～10根种于沙氏琼脂(加氯霉素)，划破斜面掩埋。
(四)脓液无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作G染色或抗酸染色，常规的KOH涂片及SDA接种培养也是必要的。
(五)CSF采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检和培养(SDA)25℃或37℃4周。
(六)血液无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA(注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。
(七)体液、痰液、尿液、粪便①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养(SDA每管种0.5ml)。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来；C.容易干竭。采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养(加抗生素)注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。
(八)组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm3的小块，KOH涂片培养。
四、真菌学检验的基本技术
(一)直接镜检
常见镜检染色方法有：①革兰染色。所有真菌、放线菌均为革兰染色阳性，被染成蓝黑色。适用于酵母菌、孢子丝菌、组织孢浆菌及诺卡菌、放线菌的感染。②乳酸酚棉蓝染色：用于各种真菌培养物的镜检。③印度墨汁：用于检测脑脊液(CSF)中的新生隐球菌。④抗酸染色：用于抗酸菌及诺卡菌的诊断。⑤瑞氏染色：用于组织胞浆菌和马内菲青霉的检测。⑥过碘酸锡夫染色(PAS)：用于体液渗出液和组织匀浆等。真菌胞壁中的多糖染色后呈红色，细菌和中性细胞偶可呈假阳性，但与真菌结构不同，不难区别。⑦嗜银染色(GMS)：真菌可染成黑色，主要用于测定组织内真菌。
(二)真菌培养
从临床标本中对致病真菌进行培养，目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，以弥补直接镜检的不足，同时确定致病菌的种类。真菌培养检查除需要一般细菌检验用到的器具外，还应准备真菌专用的接种针、接种环、或接种钩(用铂丝或镍丝制成)、微型小铲、刀片、针头等，常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂(SDA)斜面培养基，加0.05%氯霉素，还有多种性质的培养基(见第二部分)以满足各种不同的需要，可酌情选用接种的方法，根据不同的临床标本，大体可分为点植法和划线法两种。①点植法：适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、组织等有形固体标本，将标本直接与培养基表面点状接触。②划线法：适用于痰、分泌物、脓液、组织液、组织块的研磨液等液体标本，用接种针(环)划线接种在培养基表面。
(三)培养检查
五、组织病理学检查
真菌病的组织病理检查与直接镜检培养同样具有相当重要的价值，尤其对深部真菌病的诊断意义更大，如用特殊染色可提高阳性率。
真菌的组织病理反应与其他一些疾病的组织病理反应极其相似，往往只有在仔细研究了病理切片并发现了真菌之后才考虑到真菌病的诊断。而在这种情况下，标本已被固定，培养有时已不可能进行，组织病理切片就成了真菌感染的主要依据。所以临床上在送病理标本的同时，要尽可能考虑到真菌感染的可能，以便同时采集标本送真菌实验室进行真菌学检查。
真菌在组织内一般表现为：①孢子：酵母和双相型真菌在组织内表现为孢子。②菌丝：许多真菌在组织中只表现为菌丝。组织中发现无色分隔、分支的菌丝多为念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分支的菌丝为接合菌，多为毛霉、根霉、犁头霉等。粗大、少分支有隔的菌丝为蛙粪霉菌。棕色菌丝为暗色丝孢霉病，由暗色孢科真菌引起。③菌丝和孢子，主要见于念珠菌感染。④颗粒：为组织内由菌丝形成的团块。⑤球囊或内孢囊：球囊内含有内孢子，为球孢子菌或鼻孢子菌在组织内的特征性结构。
组织病理片中根据形态和染色能基本确定种名的真菌为：荚膜组织胞浆菌、杜波伊斯组织胞浆菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、链状芽生菌、粗球孢子菌、新生隐球菌和鼻孢子菌等。根据组织病理中真菌的形态能确定属而不能确定种的病为：放线菌病、奴卡菌病、无绿藻病、念珠菌病、曲霉病和不育大孢子菌病等。多个属的真菌感染可引起相同的临床表现，在组织病理中真菌的形态无法区别的病有皮肤着生芽生菌病、暗色丝孢霉病、接合菌病、皮肤癣菌病和足菌肿等。足菌肿的颗粒若染色适当，很易确定为放线菌性或真菌性的，也能区别出细菌性颗粒。真菌性颗粒中的菌丝又分为无色或暗色两大类。各种病原菌基本上形成各自顔色、大小、形成和结构的颗粒，可以初步区别，但最后确定必须依靠真菌培养。
六、血清学方法
随着诊断技术的进展，以免疫学方法检测真菌病已成为可能，引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌、曲霉菌和隐球菌等，传统的检测方法主要为血培养和组织活检，但血培养历时太长，且深部真菌感染的病原菌常不易培养成功，阳性率较低。而深部真菌感染的临床征象错综复杂，又使得组织活检缺乏典型改变，影响正确诊断，这些都使得这些方法所起的作用极为有限，真菌的抗原、抗体及代谢产物的血清学检查用于深部真菌感染的实验室检测，可取得很好的效果。目前常用的免疫诊断方法有：①特异性抗原的检测：A.乳胶凝集试验(LA)。B.酶联免疫试验(EIA)。C.荧光免疫测定法(FA)。②特异性抗体检测：由于受检者都为免疫低下患者，因其致阳性率低，故现已少用。