烈冰单细胞测序为了准确快速地进行单细胞测序研究，基于前沿的研究文献进行多重优化，真正做到准确可靠全面的单细胞测序解析
10XGenomics单细胞捕获平台起源自Drop-Seq技术，通过"双十字"微流控系统形成一个个含有细胞和凝胶微珠（aelbead）的油包水的乳滴（GFMs），其核心技术在干凝胶微珠美面的引物序列，由标记细胞的Barcode、标记细胞内mRNA的UMI和捕获mRNA的PolvdT组成。10XGenomicsChromiumTM系统可实现数千至数百万个单细胞的分析，解决常规scRNA-seq在通量或扩展性方面存在的不足。
BDRhapsody单细胞分析系统的诞生基于BD在细胞生物学领域40年的专业技术，采用CytoSeq特有的蜂窝板技术进行单细胞捕获。该技术用20W+的微孔（该数量级远大于Input细胞数量），保证单孔中的单细胞捕获。同时避免了传统微流控系统中存在的概率碰撞影响捕获效率的问题，采用微孔捕获相对会有更好的捕获效率，保证Input细胞的全面使用。
烈冰“智造”PanoCellV2.0版微孔芯片，全面升级外观、捕获材质、微孔精密程度、细胞落孔率和细胞捕获效率，提供自研蜂巢板+BD平台原装进口单细胞分选试剂+华大T7超高通量测序仪的服务新方案，达到准确稳定的单细胞实验结果，媲美BD原装的平台服务实力，烈冰智造一直不断努力提高新产品和服务水平，以提供更高效、成本更低的国产化单细胞捕获方案！
组织、血液、培养的细胞系、制备好的单细胞悬液注：若客户样本为组织，且尚未成功将组织样本消化成单细胞悬液，烈冰将尽可能提供技术及实验上的帮助，但因不同类型样本的特异性，无法保证实验方法适用于所有类型组织。
细胞活性大于70%，浓度为500-2000细胞/μl，体积不小于200μl，细胞培养基及缓冲液不能含Ca2+和Mg2+，细胞体积小于40μm。
采用Fastp软件对下机原始数据进行质控，对质控后测序数据中的cellbarcode信息及其对应的counts数进行统计，判断测序样本中实际检测到的细胞数量，获得样本的测序细胞数，并根据最终确认的cellbarcode信息提取对应的reads。
注：横坐标为细胞数量，纵坐标为每个细胞对应的平均counts数，根据曲线的斜率判断实际检测的细胞数量
以cellbarcode对应的reads为研究对象，采用STAR算法将测序数据比对到物种对应的基因组上，获得基因组比对的bam文件。再以bam文件以及基因组注释文件为研究对象，将比对到同一基因上的UMI进行合并，并去除其中重复的UMI序列，得到每个基因的UMI数量，统计每个细胞中检测到的基因数以及转录本数量，并得到表达量矩阵表。
注：左图为细胞中总共检测到的基因数量，右图为去除重复UMI后统计的基因数量
利用基因组比对结果以及表达量结果对测序检测到的细胞进行过滤，去除细胞中基因检测数少、线粒体基因占比大的细胞，统计过滤后的细胞数量并得到对应的表达量矩阵表。采用数据标准化方法（CPM/RLE/UQ/TMM/scran/Downsampling等），对不同样本中细胞基因表达量进行标准化，得到标准化后的表达量矩阵表。
注：横坐标表示每个细胞中UMI的数量，纵坐标表示线粒体基因的占比情况
基于每个细胞中的基因表达量数据，采用聚类算法对细胞进行亚群分析，同时采用t-SNE分析对细胞的分群结果进行可视化展示。同时，还可以对不同样本中各细胞亚群的占比情况进行统计分析。
Chen,etal.NatureCellBiology,2021Jan;23(1):87-98.注：左图为前列腺肿瘤组织细胞亚群鉴定t-SNE图展示；右图细胞亚群分群情况
鉴定不同细胞亚群中的Marker基因，并对Marker基因的表达分布进行可视化展示。
Zhangetal.,Glia.2021Mar;69(3):765-778.注：marker基因的FeaturePlot图和Violin图
针对所有或者特定细胞亚群，进行细胞亚群间差异表达基因筛选，获得细胞亚群间差异表达基因。
Zhang,etal.Glia.2021Mar;69(3):765-778.注：该图为不同细胞亚群间差异基因聚类分析Heatmap图
分别采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/AMIGO等GO数据库，以及KEGG数据库，对Marker基因/差异基因进行功能分析和信号通路分析，从而得到这些基因群体所显著性富集的GO条目和Pathway条目。
ZhangC,etal.JImmunotherCancer2021;9:e002312.注：该图为不同cluster之间差异基因显著富集的GO/Pathway条目
基于已知的转录因子靶点数据库，以及转录因子和靶基因的表达矩阵，采用SCENIC算法，对于转录因子的调控网络进行计算，得到在每一个细胞中表达的转录因子的调控基因以及调控强度。
Chen,etal.NatureCommunication2020;11:5077注：该图为不同cluster之间转录因子调控强度heatmap图
基因集表达激活度定量分析，采用方差膨胀因子（VIF）诊断共线性的方法对于诸如KEGG基因集、GSEA基因集、甚至研究者自己搜集的基因集在Cluster中的富集度进行分析，比较不同Cluster所富集的基因集的差异。
Chen,etal.NatureCellBiology,2021Jan;23(1):87-98.注：该图为不同cluster之间信号同理调控强度热图
Chen,etal.NatureCellBiology,2021Jan;23(1):87-98.注：细胞间状态转换的pesudotime轨迹图（左）、轨迹中细胞占比饼图（左下）和Heatmap图（右）
以细胞亚群的基因表达量数据为研究对象，获得细胞中的配体及受体基因的表达信息，采用CellphoneDB算法以及数据库，得到细胞亚群间的信号通讯关系，并计算获得关系的显著性和强度。
Chen,etal.NatureCommunication2020;11:5077注：左图：横坐标表示细胞类型，纵坐标表示细胞间通讯配受体关系，圆圈大小表示显著性差异水平，圆圈颜色越红表示细胞间通讯关系越强
以TCGA临床信息以及筛选到的关键基因为研究对象，结合TCGA临床数据，进行预后分析，获得该基因/基因集与临床预后之间的关系。
ZhangC,etal.JImmunotherCancer2021;9:e002312.注：横坐标表示生存期，纵坐标表示占比，不同颜色曲线代表不同分组