PrimerSpanner:一个高效的定点突变PCR引物设计在线工具

该公式中，[Monovalentcations]是PCR缓冲液中Na+,K+和Tris+等一价阳离子的浓度。

关于参数控制，CM区的Tm值在58~68℃(长度约为18~24bp)，保证PCR过程中引物与模板良好匹配；OL区的Tm在45~53℃(长度约为9~14bp)，一方面避免引物二聚体形成，另一方面在PCR结束后两条产物的OL区可以退火形成缺刻的质粒，在模板被DpnI切割后，可以直接转化大肠杆菌。

在PS的主界面(图3)，用户需要输入原始的DNA序列，并在突变代码(Mutationcode)中填写待突变的核苷酸字母和序号。突变代码是拟进行突变的位置和类型的描述，须按照指定规则填写。主页面给出了例子对不同类型的突变代码给出了直观的解释。如“A30”，表示原始序列中的第30位碱基为A。

表1中有对各种突变代码的详细描述，包括单个碱基突变和连续多碱基突变。在连续多碱基突变的代码中，数字为连续待突变碱基的第一个碱基的序号。对于替换和插入突变，可突变的序列长度，受限于引物的长度，一般不超过50nt。对于删除突变，长度没有特别限制。

根据用户输入的原始序列和拟突变位点，可能会初步生成几十甚至几百对可能的引物。因而一个重要的步骤是对初步设计的待选引物进行评估排序，从而给出最好的引物对供用户选择。在本工具中，PS采用了一系列的标准对初选引物打分排序，最终将排名前5对引物在网页中呈现。引物评价标准包括GC百分含量，两条引物CM区Tm值间的差值，引物序列3′端稳定性和特异性，二级结构形成可能性，引物长度等，都进行了加权打分。其中二级结构形成可能性，包括序列形成发夹结构的可能性和局部引物二聚体的可能性，这些都会影响扩增效率和突变成功率，因此在打分时，关于二级结构形成可能性,给于较大的权重。

引物得分的计算公式如下：

其中，N1和N2分别为两条引物各自形成发夹结构的最多核苷酸数，M代表引物之间形成二聚体的最多核苷酸数，PolyX代表完全相同的核苷酸数，3′Stability代表3′端稳定性(计算3′端5个核苷酸的ΔG)，Tmlow和Tmhigh分别为两条引物CM区的Tm值，L1和L2分别为两条引物核苷酸数。

为了展示PS设计的突变引物的特征，在表2中，我们给出了三种类型的突变引物示例，分别为替换、插入和删除。这些引物都已通过实验验证，具有非常高的扩增效率。

我们应用PS进行了大量突变引物设计和测试实验，达到很高的成功率。下面为两个定点突变实例，待突变的序列为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的ArsC基因，该基因已连入pET-28a(+)载体，针对Lys97和Arg98设计突变引物，分别将Lys97突变为Glu，Arg98突变为Met，突变引物序列如下(加粗斜体字母标识突变位点)：

K97E_F:5′-ACATGTAGAACGTGAGCATTGGGGTTT-3′

K97E_R:5′-CACGTTCTACATGTGGAGGCGTCATC-3′

R98M_F:5′-GTAAAAATGGAGCATTGGGGTTTTGATG-3′

R98M_R:5′-TGCTCCATTTTTACATGTGGAGGCGTC-3′

两对引物均可扩增出相应大小的目的载体片段，如图4a所示，PCR产物经过DpnI酶切消化后不需要进行胶回收，直接转化大肠杆菌感受态细胞，分别挑取一个单克隆进行测序，结果显示二者均成功突变成目标序列，如图4b和图4c所示。

经过测序验证，如图4所示，图4a为两对ArsC突变引物的PCR结果图，泳道1是用Lys97突变引物扩增得到的目的DNA电泳图,泳道2是Arg98突变引物扩增得到的目的DNA电泳图，对应的条带大小如泳道M标示；图4b和图4c分别为目的DNA经过DpnI酶切消化后转化大肠杆菌感受态细胞，挑取其中一个单克隆的测序结果，所测序列与野生型相同的部分用“/”表示，不同的位置显示相应碱基，测序结果与目标序列一致。

引物在基于PCR的实验技术中起着十分重要的作用。本工作中，我们采用了一种基于Tm计算的策略设计非对称突变引物。在此基础上，我们开发了PS在线工具，能够自动化地完成突变引物的设计。该工具设计的引物可以高效地完成PCR扩增，并且可以完成替换、插入、删除等不同类型的定点突变。经过实验验证，该工具设计的引物成功率非常高，并且不需要加入特殊酶的处理，简单高效。在未来的工作中，我们将进一步开发并扩展PS的功能及应用，如线性DNA拼接、载体构建等。