注：N为任意核苷酸；W为A/T；R为A/G；H为A/T/C；Y为T/C；V为A/C/G；
高编辑效率的gRNA通常需要满足以下设计原则：
1.sgRNA的长度：SpCas9的sgRNA一般为20nt，SaCas9的sgRNA长度为21nt；
2.sgRNA序列应尽可能覆盖最多的靶标基因转录本：针对多转录本的共有序列进行设计；
3.sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM基序之前，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳40%-60%；
4.如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率；
5.设立在独立外显子上，尽量靠近蛋白N端位置（编码区的前1/3）。若想要造成基因移码突变，需要尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子上，可增加基因敲除效率。
表2.sgRNA常用设计网站推荐
注：这些网站都是目前sgRNA设计的常用网站，采用的算法不同，各有优缺点。针对同一个基因的敲除，小伙伴们可以多使用几个网站进行sgRNA设计，对结果进行比对，根据设计原则择优选取。
下面小编以敲除人源NLE1基因为例，利用CRISPOR网站进行特异性sgRNA设计：
1、打开NCBI，选择Gene，搜索基因名称及物种名称：
2、下拉至“Gennomicregions，transcripts，andproducts”模块，查看转录本情况。如图，该基因共有两个转录本，深绿色方块代表外显子，两个转录本的共有CDS区为右边红方框圈起来的区域，为第二个转录本的完整编码区。
3、复制第二个转录本的NM号，用SnapGene打开，可显示编码区所在外显子的情况。中间有间隔的为不同的外显子。
4、点击共有CDS所在的第二个完整外显子，复制序列。打开CRISPOR网站→将序列复制至序列粘贴区→选择物种/基因组→选择适配Cas酶，点击“submit”，即可生成结果网页。
5、此处可显示特异性，绿色、黄色及红色分别表示在基因组上高、中、低的特异性。
6、选定sgRNA后，复制序列→打开NCBI的Blast模块→选择基因组Blast→选择物种→跳转至blast页面→粘贴序列→点击搜索→点击右上角切换到传统视图。
7、下拉至详细描述页，可看到完全匹配的为靶标基因所在的NC号，其余均出现不同程度的碱基错配现象，说明所选sgRNA在基因组上具备良好的特异性，可用于后续敲除实验。
以本示例中的人源NLE1基因为例，该基因的最长转录本在共有CDS之前仍包含7个外显子，仅在共有区设计一个sgRNA极大可能无法完全敲除该基因所有转录本所转录翻译的蛋白。针对这种情况，建议小伙伴们针对不同区域多设计几个sgRNA进行实验验证，检测实际敲除效率。
常用的基因敲除除了单sgRNA系统外，还有双sgRNA作用系统，设计原则及选择标准与上文所述一致，两种方法各具优缺点，具体表现如下：
单sgRNA敲除系统：在编码外显子上设计1个sgRNA，依赖细胞本身的非同源末端连接(NHEJ)机制引入或缺失碱基，造成移码突变，从最终得到的混合克隆中筛选符合实验要求的敲除阳性克隆。缺点：1、筛选鉴定复杂，无法从PCR结果直接判断敲除结果。PCR产物测序峰图解读困难，存在多重套峰的现象，需要做亚克隆分析才能获得准确的敲除结果。2、敲除效果存在不确定性，在外显子上设计sgRNA，尤其外显子较小时，容易产生新的mRNA剪切突变体，产生新的突变蛋白或者跟野生型蛋白类似的突变蛋白，导致后续蛋白检测分析结果不确定。
双sgRNA敲除系统：选择编码基数为非3倍数的外显子作为敲除区域，分别在外显子上游和下游的内含子上设计sgRNA，令两条sgRNA间的外显子序列和部分内含子序列同时被删除。其删除的编码碱基数确定，删除片段较大，只需通过PCR检测即可判断敲除结果，同时发生新的mRNA剪接突变体的概率大大降低，因而敲除效果更有保障，拿到细胞后鉴定分析也更简单。
总的来说，单sgRNA敲除系统效率高，设计简单，但后续蛋白检测风险较大，往往会出现WB敲除不干净的现象，导致敲除变成干扰；双sgRNA敲除需要两个sgRNA同时起作用，效率较低，但后续蛋白检测背景干净，结果有保证。
参考文献：
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