当噬菌体感染细菌后，病毒DNA进入细菌细胞内，细菌细胞表达Cas复合体对噬菌体DNA进行切割得到间隔序列（spacer），间隔序列在cas1和cas2作用下插入到CRISPR序列前导区下游，完成外源DNA的捕获（如图1），形成免疫记忆。
图1.细菌对噬菌体免疫-Phase1
图2.细菌对噬菌体免疫-Phase2
CRISPR/Cas可分为二大类群：Class1以多个Cas组成的效应复合体行使功能为特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；Class2则只需单个多结构域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型（表1）。Class2系统简单、高效、操作方便，是目前主要的基因编辑系统，其中最具代表性的是Cas9。
本文主要讲解Cas9。
如图3所示，CRISPR-Cas9系统由三部分组成，crRNA（读作CRISPRRNA）、tracrRNA（读作tracerRNA）和Cas（CRISPR-associated）核酸酶。crRNA和tracrRNA一起组成gRNA（guideRNA，向导RNA）。图3左边是自然界gRNA的结构，右边是人为制造的gRNA，将crRNA和tracrRNA融合为一条链（又称为sgRNA）。
gRNA骨架部分与Cas核酸酶相对应。不同的Cas核酸酶结合不同的gRNA骨架。
图3CRISPR-Cas9系统
下图以更加具体的例子来说明CRISPR-Cas9系统。
图4.CRISPR-Cas9system
Cas9蛋白结合sgRNA通过20nt长的向导RNA（蓝色）与人EMX1基因DNA结合；红色部分是sgRNA的骨架；粉色标记的是PAM序列，此处为TGG；Cas9会在PAM序列的上游约3bp出会产生一个双链断裂（DSB），图中红色箭头指示DSB断裂处。
图5spCas9的gRNA
SpCas9（常用的有两个版本）
Chen（2013）:
GTTTAAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT
Hsu(2013):
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT
SaCas9
GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTT
FrCas9
GTTTGAGTGTCTTGTTAAGAAATTAACAAGATGAGTTCAAATCAGGCTCCTAGAGAGATCCGAACTTACCTTCATGGCGGGCATTGTGCCCTTTTTT
由于Cas9会在PAM序列的上游约3bp出会产生一个双链断裂（DSB），细胞主要启动两种“DNA修复”细胞信号转导通路：同源重组修复（HDR）与非同源末端连接（NHEJ）。
HDR需要我们额外提供同源模板，如果没有同源模板，NHEJ通路发挥功能，断裂的两条DNA直接连接，同时会产生几个碱基的插入或者删除，只要插入/删除的碱基数不是3的倍数（概率为三分之二），同时DSB在蛋白的编码区，那就有可能产生移码，使得蛋白失去功能，从而达到knockout（ko）的目的。所以，为了实现CRISPRko，Spacer应该尽量避免设计在太靠近氨基端（下游的ATG可能起始翻译）或者太靠近羧基端的位置，更稳当的做法是设计几条gRNA，产生好几个DSB。
如果想通过HDR进行基因编辑，比如引入荧光标签，靶位点的选择很大程度上受到编辑所需位置的限制；当切割位点距离修复模板的近端>30nt时，效率急剧下降(Yangetal,2013)。
如果我们让Cas9失去切割双链DNA的能力，也就是不引起DSB，但仍能在gRNA的引导下，特异性地结合到目标DNA序列上，就可以实现CRISPRa(激活)和CRISPRi(抑制)技术，可以在转录水平调控基因表达。首先，我们需要一个dCas9蛋白（没有切割活性的Cas9），它是在野生型Cas9的两个关键核酸酶活性位点（RuvC和HNH）引入突变（如D10A和H840A）后得到的。当dCas9被引导到靶基因的转录起始位点TSS（transcriptionstartsite）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过，导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域，如KRAB结构域，这样的蛋白称之为dCas9-KRAB，可以进一步提高转录抑制的效率。此外，dCas9也可以融合双抑制结构域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。
当dCas9连上转录激活子（如VP64、p65和HSF1），通过gRNA引导dCas9到目标基因的启动子或增强子区域，来激活基因的转录。这些激活因子通过吸引转录机器（如RNA聚合酶和其他转录因子）增加目标基因的转录水平。
对于CRISPRa，靶向转录起始位点(TSS)上游~100nt的窗口是最有效的，而对于CRISPRi，位于TSS下游~100nt的窗口，具有最高的活性。因此要设计CRISPRa或者CRISPRi的gRNA，需要知道转录起始位点信息。
gRNA的脱靶活性是需要重点考虑的。研究表明引导序列3'端的8-14个碱基对错配的容忍度低于5'端的碱基；一般来说，超过三个错配是不能容忍的；一些引导序列对错配的容忍度低于其他引导序列；脱靶切割对转染量以及Cas9和sgRNA的相对比例高度敏感。
了解完设计的基本原则后，就可以借助在线工具进行gRNA设计了，比如CRISPick。
表1.Class2CRISPRsystem
请注意，表格中的"dsDNA"代表双链DNA，"ssDNA"代表单链DNA，"ssRNA"代表单链RNA，"PAM"代表原间隔序列(protospacer-adjacentmotif)，"PFS"代表前间隔序列侧翼位点(protospacerflankingsequence)。"反式剪切"(trans-cleavage)指的是CRISPR-Cas系统在切割目标DNA或RNA后，是否还能进一步切割其他非目标序列。CRISPR-Cas切割目标DNA或者RNA称为顺式剪切（cis-cleavage）
本公司的所有产品仅用于科学研究等非医疗目的，不可用于人类或动物的临床诊断或治疗，非药用、非食用。