我们通过不同的方法对小鼠特定基因进行靶向编辑或修饰，从而获得可遗传的基因缺失(lossoffunction)或基因获得(gainoffunction)小鼠模型，并对它们的发育、形态学、生理学、病理学等各方面展开研究。开发和研究基因修饰小鼠的目的之一，就是解决后基因组时代小鼠遗传学的主要问题：为小鼠基因组中的每个基因分配一个功能。
在我们使用基因工程小鼠模型进行课题研究的时候，离不开两个关键词。
改变目标基因（Genotype），可能会导致小鼠某些生理过程的变化（Phenotype），从而推断目标基因的功能。Genotype是因，Phenotype是果。
明确目标基因发生改变的过程叫Genotyping（基因型鉴定）。对于基因工程小鼠模型来说，就是区分野生型和突变型。发现并评估小鼠生理变化的过程叫Phenotyping（表型分析）。Genotyping是成就“因果关系”的基石。如果Genotyping出现差错，那么后续所有的Phenotyping都将谬以千里。
关于Genotyping，你大概需要知道以下这些事情。
随着基因编辑技术的发展，敲除或插入的基因片段越来越大、人为改造的基因结构越来越复杂，因此对小鼠基因组DNA模板的质量要求也随之提高。过去为了快速得到基因型结果，采用简单的碱变性快速抽提DNA方法，可以应付一些短片段的PCR鉴定。但这样获得的DNA比较“脏”，很容易发生鉴定不出结果的情况。或者使用一些直接PCR扩增试剂盒（例如：将鼠尾在试剂中浸泡20分钟后取上清直接作为模板），由于试剂盒选择的种类比较多，不同厂家的试剂盒扩增效率也不一样，因此也常常发生鉴定结果不理想的情况。
用超纯水彻底溶解蛋白酶K粉剂,使终浓度为10mg/ml，分装成1ml/vial,-20度保存。
（1）剪取小鼠尾端约0.5厘米（视鼠龄及鼠尾粗细可调整,尽量使鼠尾体积相互接近），将鼠尾放入已编号1.5ml离心管中并盖好盖子。
（2）每管加0.5ml裂解液和50μl蛋白酶K贮存液并将盖盖紧。
（3）将离心管置于杂交管中并用纸团稍加固定。
（4）将离心管置杂交炉中，56℃转动过夜。
（5）次日将样本于室温，12000rpm离心10分钟。
（6）上清倒入1.5ml离心管中，加1ml无水乙醇（约2倍上清体积），盖紧盖子后轻摇，可见絮状沉淀。13000rpm,15min,弃上清。
（7）加70%乙醇1ml，洗涤，13000rpm离心10~15min，弃上清，收集沉淀，室温晾10~15min。
（8）每管加80~100μl灭菌水，盖好后置室温或37℃1小时充分溶解。在室温中放置数小时，待DNA全部溶解后-20℃保存，或直接进行PCR或杂交等实验。如DNA溶解不完全,在37℃水浴中放置30~60min，但不可过夜。DNA样品的OD260/280在1.8-2.0之间。
裂解鼠尾一定要充分，有条件尽量使用杂交炉。因为如果裂解过程中组织与裂解液始终保持静止，而没有翻转的过程，这会导致DNA和鼠毛之类的杂质没有完全分开。离心去除杂质的过程中，DNA就会随着这些杂质一起被抛弃了。
基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳对比不同基因型特异产物的大小（一般差异在100bp以上），根据电泳条带差异来直接区分小鼠的不同基因型。
适用于：
Knockout（包括CRISPR介导片段敲除）
Conditionalknockout
Knock-in（片段敲入）
常规PCR电泳结果示意图：
如果目标基因突变的碱基数很少，很难通过PCR产物大小来直接区分，那么有以下几种方法来鉴定基因型。
1）对于多个碱基连续突变的情况，可以采用三引物的方法，一条为共用引物，另外两条为差异引物。这两条差异引物的3’端设计在发生突变的区域，利用针对野生型引物只能扩增出野生型条带，针对突变型引物只能扩增出突变型条带的原理，区分野生型、杂合子和纯合子基因型。这种方法受引物设计位点的限制、同时对PCR条件的要求很高，较易出现假阳性情况，因此不太实用。
2）可以利用突变前后酶切位点的改变，通过对比酶切产物来区分基因型。该方法仅限突变产生了新的酶切位点或导致原有的酶切结果条带大小发生明显变化。操作起来比较繁琐，同样也有假阳性、假阴性的情况。
3）可以采用TA克隆和测序的方法，通过测序峰型图来判断（如下图所示）。几乎适用于所有点突变情况，而且结果可靠性高，是性价比非常高的鉴定方法。
Knockout（CRISPR介导NHEJ产生Indel）
Pointmutation（CRISPR介导HDR）
如下图所示，图A为野生型小鼠PCR产物测序峰图。图B为阳性F0代小鼠基因型鉴定PCR产物测序峰图。CRISPR/Cas9作用后，由于发生NHEJ随机修复，产生多种基因型，在Cas9切点附近出现杂峰。图C为阳性F1代小鼠基因型鉴定PCR产物测序峰图。阳性F1小鼠基因组一个拷贝是野生型，一个拷贝是突变体，在Cas9作用位点附近区域测序有后双峰现象（两种基因型产生了两种峰型）。图C’和图C”是图C中测序PCR产物连接T-vector后，单克隆测序结果。其中，图C’为野生型，图C”为突变体。峰型对比可以发现C”较C’缺失了两个碱基CC。C’和C”峰型结果可以和C图峰型结果向吻合。
如下图所示，图A为野生型小鼠PCR产物测序峰图。图B为阳性F0代小鼠基因型鉴定PCR产物测序峰图。CRISPR/Cas9作用后，由于发生同源重组修复(HR)的同时，也可能发生非同源重组修复(NHEJ)。因此，切点附件可能出现杂峰。图C为阳性F1代小鼠基因型鉴定PCR产物测序峰图。阳性F1小鼠基因组一个拷贝是野生型，一个拷贝是突变体，在Cas9作用位点附近区域测序，突变点位置有双峰现象（野生型和突变体，两种基因型产生了两种峰型）。图C’和图C”为图C中测序PCR产物链接T-vector后，单克隆测序结果。其中，C’为野生型，C”为突变体。峰型对比可以发现C”较C’的目的突变点CCT突变为GTT，C’和C”峰型结果可以和C图峰型结果相吻合。
双引物（一对）方案：分别在敲除片段的上下游各设计一条引物。下图B为小鼠ES细胞打靶途径的引物策略与PCR产物大小示意图。下图C为CRISPR途径的引物策略与PCR产物大小示意图。
双引物（一对）方案：可以分别在flox区域上下游各设计一条引物。下图为小鼠ES细胞打靶途径的引物策略与PCR产物大小示意图。图A可鉴定flox小鼠中Neo基因是否被去除；图B则示意了在特定组织中flox区域是否被敲除。CRISPR途径构建的CKO小鼠模型的引物设计策略也可参考下图，去除frt-Neo-frt结构。
四引物（两对）方案：小鼠ES细胞打靶途径或CRISPR途径构建的KI小鼠模型，都可以参照以下策略来设计鉴定引物。第一对引物分别设置在敲入位点上下游；第二对引物中的一条设计在敲入序列上，另一条设计在同源臂上。且两对引物的PCR产物大小具有明显差异。
双引物（一对）方案：针对包含点突变位置上下游共约300-800bp的区域设计PCR引物。获得的PCR产物通过酶切或测序的方法判断基因型。
由于每个实验室、每台PCR仪的实际条件不同，因此即使是被验证过的PCR体系，在不同的实验室中可能也会有不成功的情况。
以下几点Tips也许可以帮你：
在一般的Genotyping里面，每一次鉴定都至少要设置一个WTControl和一个H2O，也就是BlankControl。
1）帮助我们快速判断基因型。在Flox小鼠或片段knockin小鼠的鉴定中，如果产物条带仅有一条或其中有一条与WTControl一致，那么可以判断该样本为WT或杂合子。
2）帮助我们判断PCR体系是否work。如果PCR产物在跑电泳的时候连WTControl的样品都没有出条带，那么说明PCR体系有问题，需要做相应的调整，比如考虑更换引物或PCRmix等。
H2O对照主要是用来质控PCR体系是否发生了污染。如果H2O对照都有条带，说明整个PCR体系存在污染的问题，这个PCR结果不可信。
InternalPositiveControl内部对照引物通常扩增与目的基因无关的基因组DNA区域。一般用在随机插入转基因小鼠的鉴定中。通常转基因鉴定引物是只针对插入的外源DNA序列的，所以没有发生随机整合的小鼠DNA模板不会有PCR产物产生。这样一来很容易发生假阴性的问题。也就是说电泳没有条带，我们无法判断到底是外源基因未整合的阴性结果，还是由于PCR体系本身的问题造成阴性结果。所以需要另一对在所有小鼠中都能获得PCR产物的阳性对照引物作为内控，即InternalPositiveControl，用于判定PCR体系和模板质量是否合适。
Cre-ERT2在无Tamoxifen诱导的情况下，在细胞质内处于无活性状态；当Tamoxifen诱导后，Tamoxifen的代谢产物4-OHT（雌激素类似物）与ERT结合，可使Cre-ERT2进核发挥Cre重组酶活性。
常见的基因工程小鼠可以分为两种命名方式，包括基因定点修饰的小鼠命名，比如：敲除、敲入、点突变等等，和随机转基因的小鼠命名。