CRISPR核酸检测新应用：MPXVCRISPR诊断试纸条高度准确且“比任何其他方法更快”

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CRISPR核酸检测新应用：MPXV-CRISPR诊断试纸条高度准确且“比任何其他方法更快”

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《柳叶刀微生物》新发表的一篇研究介绍了澳大利亚研究人员为应对猴痘病毒(MPXV)的全球爆发，利用CRISPR技术开发的澳大利亚首个MPXV-CRISPR诊断工具。试纸条设计便携且成本低，更适合即场检测要求，将来有望成为核酸检测的补充和替代

在《TheLancetMicrobe》期刊上发表的一项合作研究中，由PeterDoherty感染与免疫研究所(Doherty研究所)和WEHI(WalterandElizaHall医学研究所)领导的科学家团队介绍了MPXV-CRISPR——一种强大的诊断工具，能够在临床样本中检测MPXV，具有高度的准确性，并且由于CRISPR技术的力量，其速度比任何其他方法都要快。这是澳大利亚第一个基于CRISPR的诊断方法，专门针对MPXV中发现的基因序列。

研究背景解读

以基因组编辑能力而闻名的CRISPR技术，亦可用于设计功能强大且高度敏感的诊断工具。

早在2017左右，CRISPR技术的领头羊——JenniferDoudna和张锋先后报告过利用Cas12和Cas13家族具备collateralcleavage能力（或称为cleavageintrans）成功设计了基于CRISPR的核酸分子检测方法。简单来说，Cas-crRNA复合物识别并结合底物后，不仅能切割底物，还能切割游离在环境内的任意底物，这种能力被称为反式切割（collateralcleavage）。检测方法的基本策略是利用等温核酸扩增技术使底物浓度增加，再利用Cas复合物识别并结合底物后的反式切割能力，切割报告分子，使荧光基团游离而被检测到。等温核酸扩增技术与CRISPR-Cas介导的靶点识别的联合具有高灵敏度和特异性，相对简单便捷（RPA只需37℃）、耗时短、价格低廉，可能是更适合即场检测的方法，为包括mpox在内的感染性疾病的低复杂性即场检测提供了机会。

primer-gRNA设计

这项概念验证研究采用一种基于CRISPR-Cas12的便携式等温扩增检测MPXV的方法。墨尔本大学的研究人员利用从美国国家生物技术信息中心(NCBI)下载的523个MPXV基因组数据库，来设计重组酶聚合酶扩增(RPA)引物和CRISPRgRNA(CRISPRguideRNA)：首先鉴定了MPXV中高度保守的基因(存在于≥90%的基因组中)，并进行了个体比对，将其用作引物和gRNA设计的靶点；另外再采用基于k-mer的方法来鉴定MPXV独有的22-mers到24-mers，并将其与TTTV原间隔区相邻的基序位点作为gRNA结合位点，引物随后被设计在该区域的两侧。根据计算机模拟结果(灵敏度≥90%，特异度为100%)，共得到22组引物-gRNA组合。随后使用基于荧光的读取结果来评估分析灵敏度和特异性，筛选出3个产生最强信号的组。进一步分析显示最高灵敏度(LOD为1个基因组拷贝/μL)的引物-gRNA组合经过灵敏度和特异性分析，对523个MPXV基因组的识别能力分析，最终入选。

横向流试纸条设计

MPXV-CRISPR检测包括用引物对样本进行20分钟/39℃等温扩增，20分钟/37℃的CRISPR试剂反应，以及5分钟的横向流试纸条（lateralflowstrip）检测。

试纸条的设计跟张峰的SHERLOCKv2版的lateralflowstrip设计相似，他们采用了两端连有发光基团FAM和生物素biotin的报告分子。在室温下将25μLMPXV-CRISPR检测试剂加入75μLHybriDetect检测缓冲液中。将横向流试纸条浸入总体积中5分钟后进行读数。

带有抗FITC抗体的金纳米颗粒预置于试纸条的样品上，生物素配体固定于质控线（controlline），抗兔抗体固定于检测线（Testline）。将样品反应液滴在样品垫上，报告分子的FAM部分与抗FITC抗体的金纳米颗粒结合，并在毛细作用下样品向前流动，当目标DNA不存在的情况下(阴性检测)完整的报告分子的生物素部分被质控线的生物素配体俘获，质控线显色，检测线不显色；而在目标DNA存在的情况下(阳性检测)Cas复合物结合靶标并切割靶点，连带发生反式切割将报告分子中的FAM和生物素切开，被切割下来的生物素部分与生物素配体结合，质控线显色，而被切割下来的FAM部分与抗FITC抗体金纳米颗粒结合继续向前，在检测线上被抗兔抗体捕获显色。

作者的话

根据世卫组织诊断检测应准确、可获得和负担得起的标准，该小组正在努力将MPXV-CRISPR改造成一种便携式设备，有朝一日可以在全国各地的医疗点部署，以便快速现场检测猴痘病毒。WEHI的高级研究官员、Doherty研究所初级实验室主任、该论文的共同资深作者ShivaniPasricha博士说，MPXV-CRISPR有可能彻底改变我们管理痘的方式，对公共卫生产生有意义的影响。“通过改善澳大利亚各地(包括资源有限的地方和偏远地区)获得快速可靠诊断的机会，这种分散的检测方法可以加快治疗速度，改善患者的预后，同时加快我们管理未来疫情的能力。”

THE END

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1.求助crisprcas9引物设计软件动植物小木虫我知道有两个在线设计引物的软件,不知道是不是你要的 http://crispr.mit.edu/ http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html 就算不是,我觉得你说的那个肯定也是在线设计引物的,不防把关键词在Google里 谢谢你的回复,我也知道有在线设计的软件,但选起来相对复杂,我看文献里他那个挺简单方便的,https://muchong.com/html/201511/9576640.html
2.如何正确设计引物?pcr引物设计详细步骤不需连接酶,不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列,然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中,在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。 14. 兼并引物 有时候,对于引物设计仅了解有限的序列信息。比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设https://www.magigen.com/how-to-design-pcr-primer.html
3.阳性克隆筛选方法汇总——基于ZFNTALENCRISPR/Cas9基因敲除引物设计推荐选择靠近靶位点上游100bp和下游200bp处,或者上游200bp和下游100bp处,这样的好处是后面进行酶切分析的时候,对于阳性的克隆,可以很容易观察到2条分开的条带。 Taq酶,建议是用NEB的Fusion或者Q5,毕竟敲除本身很大可能也就是2-3个碱基的缺失,所以,高保证是必要的,防止产生假阳性的结果。 https://www.biodiscover.com/reaseach/116765.html
4.CRISPRCas9基因编辑2gRNA设计(下)3. 设计检测所需引物 这里检测所用的引物和平时做PCR检测mRNA表达的引物是不同的,这里的PCR产物必须覆盖基因编辑的位置,且产物要足够长,至少500 bp。在这里我们以P53为例子: (1)找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列(2000 bp) image.png (2)将找到的序列复制粘贴到blast中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/https://www.jianshu.com/p/0a3ffd23bdff
5.GeneiousPrime2022破解版GeneiousPrime2023.1w在一个界面中执行各种克隆和引物设计操作。自动注释质粒图谱和表达载体。模拟各种分子克隆操作,包括限制性克隆,Gibson组装,Gateway克隆和TOPO克隆。设计和测试引物,找到CRISPR位点,并优化密码子。 3、数据管理 只需拖放即可以通用文件格式(包括Genbank,SnapGene,FASTQ,FASTA,BAM,VCF,GFF)导入,导出和转换序列,注释和注释,http://www.sd173.com/soft/9265.html
6.想筛就筛,CRISPR文库一站式服务低至2.4w,立省2w!CRISPR文库能够在全基因组范围内进行筛选,可以高效地研究基因功能以及发现靶点。然而,CRISPR文库筛选整个工作流程涉及多个步骤与实验,对于新手小白来说,无疑是个巨大的挑战。 源井CRISPR-iScreen?一站式筛选服务￥2.4w起,最高立省2w+;还有400+文库https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU3MTE3MjUyOA==&mid=2247673607&idx=2&sn=cd6115639a78cbc3e3b668999f0f5010&chksm=fd9c5f6e5c10b141d5fa7b8d9cc9fd6fc8ef6418ee733a86213ea3c4b0b578606854f2cd3699&scene=27
7.CRISPR1. 目的基因sgRNA设计 ” 目前设计sgRNA的网站比较多,张锋老师实验组总结了sgRNA设计工具如:https://zlab.bio/guide-design-resources,其中synthego(https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-design-tool)是小编比较喜欢用的设计工具。不过该网站只能设计人、果蝇和小鼠基因的sgRNA。以人的基因TP53为例http://www.dentalearner.com/archives/3855
8.质粒构建软件中的CRISPR设计功能,助力精准基因编辑2.CRISPR设计:质粒构建软件中的CRISPR设计功能可以根据用户输入的目标基因信息,自动设计出符合特异性、GC含量均衡等原则的gRNA序列。此外,软件还能模拟基因编辑过程,预测可能的编辑结果,帮助科研人员在实验前优化实验设计。 3.引物设计:质粒构建软件通常还提供引物设计功能,以支持PCR扩增等实验操作。软件能够根据用户输入的https://www.yanyin.tech/cms/lBoB1pz4.html
9.CRISPRPrimerDesignerv1.1.2x64primerblast报错nohash资源CRISPR primer designer 本地化运行的单机版基因编辑引物设计软件、提高基因编辑特异性、自动分析Blast比对结果,直接生成最终引物,内置拟南芥和水稻基因组序列,自定义基因组后也可支持人、小鼠、果蝇、斑马鱼等多个物种的基因编辑引物设计。 简易使用教程:第一步:把基因的 CDS 序列(注意是编码区序列)贴到框里,勾选 https://download.csdn.net/download/zhouthrone/12097004
10.标签蛋白纯化:原核表达载体构建方法详解企业动态如若扩增片段序列,需要在上游引物加上起始密码子,在下游引物加上终止密码子。常见的起始密码子为ATG,终止密码子通常为TGA,TAA,TAG。若载体上无标签,构建载体时可在上游引物前端或下游引物后端添加标签序列,这样即可把标签添加到序列的N端或C端。 引物设计的原则: https://www.biomart.cn/news/16/3011549.htm
11.RPA引物设计深圳易致生物科技有限公司,基于DNA/RNA快速扩增技术,设计、研发与转化病原微生物快速检测产品。拳头产品:超敏胰岛素ELISA试剂盒,支原体检测试纸条,支原体清除剂,支原体预防剂,恒温PCR,CRISPR,Cas12a, Cas13ahttps://ezassay.com/primer
12.CRISPR/Cas9载体设计与构建的作用机理CRISPR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9) 技术是最近发现的一种基因组靶向修饰技术。与之前的技术相比,CRISPR/Cas9技术是通过一段RNA来识别靶位点,因而在设计和构建上更加简单。迄今为止,CRISPR/Cas9技术已成功应用于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae、大肠杆菌https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_5909.htm
13.Cas9基因敲除大肠杆菌BL21菌种中的lacZ基因通过CRISPR/Cas9编辑β--半乳糖苷酶基因,造成β-半乳糖苷酶基因功能缺失,编辑后的BL21菌种将不能代谢X-gal产生蓝斑。 实验材料 大肠杆菌Cas9基因编辑试剂盒(英茂盛业,CR3011) Clone Direct PCR Mix(英茂盛业,P3001) 靶点和实验方案设计 根据BL21中β-半乳糖苷酶基因序列,设计基因敲除靶点和重组修复模板。 设计https://www.inovogen.com/geneknockout/support/2016/1230/441.html
14.chopchop指南:CRISPR设计在设计CRISPR时,我通常会使用两个网站:CRISPOR和chopchop。对于同一个基因或位点,我会分别用这两个网站进行设计,然后比较结果,这样更保险。不同的网站可能采用不同的计算规则,即使针对同一种排序标准(如效率或特异性),不同的gRNA排序也会有所不同。虽然我并没有专门研究过这些规则,但可以确定的是,CRISPOR和chopchhttps://mbd.baidu.com/newspage/data/dtlandingsuper?nid=dt_5580256992045595413
15.MeRIPqPCR方法原理结果含义展示方法及应用细谈3.MeRIP-qPCR引物如何设计? 由于目的是定量位点的修饰水平,因此MeRIP-qPCR的引物不仅是针对目标基因,还要是针对其上的那个修饰位点(区域)。这个位点信息可以从: (1)MeRIP-seq的测序结果中筛选得来 通常是一段位置坐标,比如云序生物提供的MeRIP-seq结果,某个甲基化峰位置如:chr1:111234-111567。有了这个位置信息,可https://www.bio-equip.com/showarticle.asp?ID=453117433
16.列出给出序列的crispr引物OAmaque列出给出序列的crispr 引物 手动寻找cripsr 引物比较麻烦,而现在有些网站可以完成这一任务,但是,用python 去实现它也很简单。以下是脚本: 1#!/usr/bin/python2#list all crispr-target(20 bp + NGG)34importre5fromBio.Seqimportreverse_complement # use Biopython module67genome_seq = open("seq.txt")8https://www.cnblogs.com/OA-maque/p/4808859.html
17.一种高效无选择标记的黑曲霉基因组编辑方法隐藏缩略图 本文结构 摘要 关键词 Abstract Keywords 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和培养基 1.1.2 主要试剂 1.1.3 引物 1.2 方法 1.2.1 CRISPR/Cas9质粒的构建 1.2.2 多靶位点sgRNA表达盒及供体DNA片段的设计 1.2.3 原生质体转化及转化子筛选 1.2.4 靶向质粒的丢失 2 结果与分析 2.1 CRISPR/Cas9https://cjb.ijournals.cn/html/cjbcn/2022/12/gc22124744.htm
18.科学网—Microbiome:华中农大谢卡斌组利用CRISPR系统改进16SrRNAPCR钳(oligo),最初设计用于在PCR期间抑制特定等位基因的扩增,从而能够显著减轻16S-seq中宿主16S rRNA基因的污染。PCR钳利用肽核酸(PNA)和锁定核酸(LNA)寡核苷酸来阻止PCR延伸或引物结合靶标DNA。少数宿主特异性PNA和LNA的寡核苷酸被设计用来特异性抑制质体和线粒体16S rRNA基因的扩增。然而,最近的一项研究发现,PNA寡https://wap.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=3334560&do=blog&id=1237160