CRISPR之父张锋最新综述：全文精彩内容
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CRISPR-Cas的发现刺激了对原核防御系统的原理和作用机制的广泛研究。张锋等人探讨了免疫和程序性死亡PCD之间的关联，其中重点放在了最近的发现，即研究表明一些防御系统，免疫和PCD能有效合并。
摘要：
宿主-病原体之间的军备竞赛，是生命进化中的普遍且核心的一面。大多数生物在进化中发展出了多重不同但相互作用的抗病原体防御策略，包括对寄生生物侵袭的抵御，先天和适应性免疫以及程序性细胞死亡（PCD）。PCD是对付感染的最后的手段——当抵抗和免疫失败时被激活的自杀反应。受感染的细胞要在两个选择之间做出决定：是主动防御还是利他主义的自杀/或是休眠诱导，这取决于免疫是否“被认为”能够防止寄生生物繁殖和随后感染其他细胞。在细菌和古细菌中，免疫基因通常与PCD模块共定位，类似毒素-抗毒素，提示免疫-PCD偶联可能由共享蛋白质介导，这类共享蛋白质可能感测损伤和“预测”感染的结果。在VI型CRISPR-Cas系统中，在免疫和PCD整合的情况下，负责灭活靶RNA的相同的酶有可能也负责执行细胞自杀。
前言：
免疫系统具有内在的自杀潜力
PCD是利他主义自我毁灭的专用机制，即使除了这种程序性死亡，免疫机制本质上也是自杀式的。简化考虑能使这一点很明显。免疫是一系列机制的集合，用于破坏寄生生物并终止其繁殖——包括各种“可移动”的遗传元件，如病毒。考虑到遗传系统在所有生命，细胞或病毒中的基本统一性，从设计上来看，免疫性是危险的，因为它不可避免地攻击宿主本身，除非始终保持检查。在最一般的意义上，这是热力学定律的结果，它不允许没有相应的能量消耗的无误差信息传输[28,29]。许多往往具有毁灭性的自身免疫性疾病是一个明显的例子[30,31]。此外，CRISPR-Cas系统的自身免疫已被证明[32-34]，符合“它是免疫系统不可分割的一部分”的观点。因此，免疫系统只有当伴随有效的自我/非自我识别机制才能得以维持，而这种自我/非自我辨别是随着免疫本身而不断进化的。这在什么情况下会发生呢？当保护自我防御寄生生物的利益更大时，和/或当免疫系统本身具有自私元素的性质并变得对宿主“成瘾”时，如本节后面所述。
自我/非自我识别的原则在先天免疫与获得性免疫之间存在很大差异，这些区别反映了这两种免疫之间的主要差异。先天免疫系统能识别自我的通用属性，经常是这些系统本身引入的修饰。许多，高度多样和丰富的限制修饰（RM）系统可能是最明显的例子[35-38]。
最常见的RM模块（称为II型）由两种蛋白质组成，其中一种是甲基转移酶，其负责自身的修饰（甲基化）；另一种蛋白质，核酸酶，靶向和破坏所有未修饰的DNA，从RM的角度来看相当于“非我”部分（在RM系统中这个方面有非常多的错综复杂的变化，我们没有机会在这里描述）。
RM系统与典型的毒素-抗毒素（TA）模块有很相似的关键特征，在原核生物中专用的PCD诱导物比RM更丰富[9,39,40]。在RM和TA模块中，都有模块的一部分扮演毒药，而另一部分扮演解毒剂。这两类系统之间的相似性非常明显，有时它们被一起被分类为毒素-抗毒素[41]。然而，与专用自杀系统相比，毒药和解毒剂在免疫系统中的功能不同（图1）。在免疫系统中，毒物（例如限制性内切核酸酶）直接攻击外源DNA，而解毒剂（例如相应的甲基化酶）保护宿主基因组。相比之下，在专用PCD系统中，毒物针对重要的宿主分子——例如在TA系统的情况下的mRNA，这个系统中mRNA干扰酶作为毒素。抗毒素可逆地使毒素失活，从而保持两种组分之间的平衡。TA系统存在许多变化，其中抗毒素功能不同，例如，可通过灭活毒素mRNA[41-43]。
图1免疫和程序性细胞死亡：不同但耦合的防御战略。通过甲基化保护宿主DNA不受限制酶的作用，而侵入的DNA则对限制酶是敏感的。先天免疫，以RM系统的形式，可以灭活寄生物DNA并阻断感染。然而，如果先天免疫失败（例如由于寄生物编码的对抗防御系统的活性）并且寄生物复制，则感染会诱导基因毒性应激，这个过程将激活蛋白酶切割抗毒素。而多余的毒素活化将导致休眠或PCD。M，修饰酶;R，限制酶;T，毒素;A，抗毒素;MGE，移动遗传元件。
RM系统的自杀潜力是显而易见的：当宿主DNA的甲基化水平明显下降时，限制性内切核酸酶将杀死宿主。至少在一些RM系统中，通过与TA系统作用相似的质粒解离后致死系统(PSK，post-segregationalkillingsystem)已经证实了这种潜力：一旦RM系统从细胞中丧失，修饰甲基化酶的稀释导致甲基化不足而暴露的DNA被剩余的限制酶切割，从而导致细胞死亡[44-46]。其它RM模块在特定压力条件下会攻击自身DNA，特别是在复制叉[47,48]。此外，当噬菌体携带自身的甲基化酶在新位点甲基化宿主DNA，导致其被IV型酶识别为非自身时，IV型限制系统（不是RM，因为这些缺乏修饰组分）就变成自杀性的了[49]。RM和TA系统对宿主细胞具有成瘾性，因为在细胞分裂期间，当编码两种组分或仅抗毒素的基因丢失时，抗毒素迅速丧失活性（在RM的情况下为稀释，在TA的情况下为降解），并且通常，保留下来的足够的毒素足以杀死微生物细胞。综合起来，所有这些证据表明，尽管免疫显然是RM系统的主要作用模式，但它们不仅偶然会自杀或嗜质粒解离后致死，而且在各种不同情况下，实际上会转变为PCD机制。鉴于它们的成瘾性和频繁以质粒形式转移，RM和TA系统可以被认为是一种特殊类型的移动遗传元件[50]。
就自杀潜力而言，适应性免疫系统CRISPR-Cas似乎在这方面特别危险。实际上，CRISPR-Cas基因座整合入了独特的间隔区Spacer，用作识别和切割靶核酸的指导[17,18]。显然，通过这些引导件的自我识别——举例说，靶向Spacer本身——将是有害的并且可能是自杀性的。CRISPR-Cas系统已经发展了针对这种直接自身识别的特异性保护，通常以序列基序（PAM，间隔子-相邻基序）的形式，这是原Spacer获取和后继识别所必需的，但在CRISPR中缺失，以这种方式阻止靶向自我[51-55]。
然而，对于CRISPR-Cas系统易于发生的自杀性自身免疫的倾向来说，CRISPR阵列的直接自我识别只是自杀性自身免疫的一种形式。第二个涉及从宿主基因组获取spacers的明显可能性，随后是自杀性靶向[32-34]。仍然不清楚究竟CRISPRCas系统是否能避免这种形式的自身免疫，以及如何避免。
在一个模型系统-IE亚型CRISPR-Cas中，已经证明实质性（尽管最有可能，不完全）的自身/非自我识别可通过识别正在进行RecBCD介导修复的主动复制的DNA实现[56]。然而，在另一个模型中，即II-A亚型CRISPR-Cas，似乎没有这样的辨别机制：大多数细菌细胞被杀死，但是显然保护少数的益处超过了自杀行为的有害影响[57]。
在原核生物中免疫和PCD机制的基因的共定位及其蛋白质的相互作用意味着功能偶联
除了免疫系统的自杀特征，编码这样的系统的基因组位点通常还包括专用的PCD模块，例如TA，并且，两种类型的防御系统会共享一些蛋白质（图2）。CRISPR-Cas，原核防御系统重最复杂的一类，再次给出了最显著的例子。CRISPR反应的第一个配对阶段Cas2的关键蛋白之一是mRNA干扰酶VapD家族毒素的衍生物[58,59]。Cas2在CRISPR-Cas中的主要作用是适配复合物的结构支架，其中Cas1是活性内切核酸酶组分[60-62]。干扰酶催化位点在一些Cas2蛋白（但不是所有）中是保守的，并且已经显示Cas2的催化残基对于适配不是必需的[60]。因此，至少在某些CRISPR-Cas系统中，Cas2可能作为RNase发挥次要作用，可能是作为毒素[26]，尽管在大肠杆菌中过表达的Cas2蛋白的催化活性似乎没有毒性。事实上，几个Cas2蛋白针对DNA和RNA的非序列特异性核酸酶活性（但对RNA底物有一定的选择性）已经得到证明[63-67]。Cas2的核酸酶活性在CRISPR-Cas功能中的作用仍然是模糊的，但是催化位点的进化保守意味着它在至少一些微生物中是功能性的。
除了CRISPR-Cas系统，比较基因组分析揭示了专用PCD系统（TA）与先天免疫基因座（如RM[9,26]）的优先关联。总之，这些观察提示了免疫和PCD/休眠之间的功能耦合的假说[26]。这种耦合的两个版本被考虑。首先，并且最直观地，PCD可以被视为最后手段的策略，其中防御系统感测到在给定细胞中阻止病毒繁殖的行动即将失败，并且相应地切换到自杀模式，牺牲感染的细胞，但是节省其他细胞人口。或者，若已经推测到将面对强烈的病毒繁殖，免疫系统将开启休眠诱导机制，因此，不仅保护周围细胞，而且潜在地，给予感染的细胞一旦病毒清除就恢复的机会。这两种策略可能不一定完全不同，因为并没有一个保证能一定让细胞从休眠中重新复苏。在许多CRISPR-Cas基因座中存在编码蛋白质的基因，其中CARF结构域与多种核酸酶融合[69]（图2），这意味着一种有趣的可能性——CARF结构域作为免疫失败的传感器系统，在与病毒的战斗中，可能响应某个仍然有待识别的警告信号（alarmone）。
免疫自杀联合假说是基于多个但间接的证据线索来解释的。然而，这种类型的偶联的实验范例，可由包括含有HEPN结构域的核糖核酸酶的抗噬菌体防御系统提供。这些核糖核酸酶，细菌RloC和PrrC蛋白是反密码子核酸酶（ANCases），它们都由N末端NTPase结构域和C末端HEPNRNase结构域组成[73,74]。PrrCACNase通常被细菌I型RM系统的组分可逆性失活，但能被一个噬菌体RM抑制剂活化，导致在tRNALys的反密码子环中产生一个切口，从而阻断噬菌体晚期蛋白的合成[75]。该回路显示了预测的免疫和PCD之间的耦合：对一个先天免疫系统（RM）的抑制，可通过激活毒素从而触发PCD。PrrC活性另外还可通过GTP水解而激活，并可通过在噬菌体感染的细菌细胞中所积累的dTTP稳定[76]。因此，PrrC实际上是通过感测由感染的细菌发射的多种信号而被激活的毒素。噬菌体已经发展了他们的ow，复杂解毒剂，即一对酶，多核苷酸激酶和RNA连接酶，一起修复由PrrC切割的tRNA分子[77,78]。
在下一节中，我们讨论一个可能直接将CRISPR-Cas与休眠诱导相联系的最近发现。
VI型CRISPR-Cas系统：双重免疫自杀功能
通过全面搜索“能编码含有可作为CRISPR-Cas效应子的潜在核酸酶结构域的大蛋白的基因位点”而驱动，最近发现的新的2类CRISPR-Cas系统，已经揭示了迄今为止或许可以说是微生物免疫和PCD最直接的联系[82-84]。VI型效应蛋白含有两个HEPN结构域，预期具有RNase活性[82,84]。这种需要两个HEPN结构域的活性实际上已经在亚型VI-A效应子（表示为C2c2，或临时，Cas13a）[83]上得到证明。正如预期的RNA靶向CRISPR效应，Cas13a可提供针对RNA噬菌体MS2的有效的保护。此外，Cas13a表现出独特的能力，虽然显然非常不寻常，可能已经被预测。当用一个同源RNA引导时，该蛋白质变成一个无规则的RNA酶，没有序列专一性地切割存在于反应混合物中的任何RNA分子（图3）。
此外，当Cas13a与同源RNA共表达时，观察到细菌活力的降低，提示可能发生休眠诱导[83]。考虑到RNA噬菌体对细菌病毒球的显着微小贡献[85]，似乎最可能的是亚型VI-A的主要功能是DNA噬菌体的防御，这是通过对同源噬菌体转录物的识别，触发毒性效应实现并导致休眠或PCD。显然，这一假设仍有待直接测试。
图3VI类型CRISPR-Cas系统：将免疫与PCD合并。在用可获得同源间隔区的RNA噬菌体感染时，Cas13a-crRNA复合物识别靶并使其失活。然而，对DNA病毒的防御被认为是通过PCD途径进行的，由此靶标（病毒转录物）的识别触发Cas13b的构象变化，使其变成非特异的RNA酶。这种活动然后导致休眠或PCD，从而防止病毒繁殖。根据[83]的许可修改。
什么控制着生死攸关的决定，为什么要用专用的自杀机器呢？
无论打开自杀程序的细胞是否立即杀死自己、或进入休眠状态以保留机会复活，作出决定的因素是相同的：细胞必须“预测”感染结果以及所采取行动的结果（图4）。如果在免疫系统识别外来侵入之后，传感器模块“预测”攻击可能是可控的，则免疫系统被动员激发出其全部能力。如果正相反，预测是可怕绝望的，自我毁灭计划就会开启。传感器读取的信号在不同的防御系统之间可能不同。在一些情况下，可以直接测量对细胞的损伤（基因毒性应激水平），如通过RloC[80]的DSB检测所示例。相同的ACNase以及PrrC也感测在噬菌体感染期间积累的dTTP的浓度增加，并用作有效的信号警报[76,86]。在CRISPR-Cas系统的情况下作为CARF结构域信号的配体仍然有待鉴定，但是CARF结构域[69]作为免疫和自杀反应之间的切换开关的可能性似乎是存在的。开关信号的性质，它们的阈值和由什么决定这些，以及这些特征是否具体取决于病毒-宿主相互作用的特性，都是进一步研究的有趣方向。
VI-A类型CRISPR-Cas系统（和很可能的，VI型的其它变体）是一种特殊情况，因为它们似乎通过跳过或至少简化损伤感测步骤来缩短典型的防御转换，并使用主要免疫效应物作为自杀效应器（图3和图4）。事实上，在体外，当唯一的信号来自于目标的识别时Cas13a切换到混杂模式（promiscuousmode，生物通译）[83]。VI类型系统在细菌中是罕见的[84]，这可能反映由于它们对入侵DNA的“恐慌”反应，这些系统对宿主是高代价的。然而，即使在这种情况下，也可能发生通过Cas13蛋白本身对目标RNA浓度的感测以反映感染复数以及病毒基因组的表达强度。涉及专用“预测模块”（传感器）（图4）的更复杂的防御策略（例如1类CRISPR-Cas）应该胜过在第一次报警信号处就激活自毁程序的简单防御策略。
具有其自杀趋向性的免疫系统，特别是专用自杀装置，都易于失火，因此对于生物体是代价昂贵的。那么，广泛（虽然不是普遍的）存留下来的两种代价昂贵的防御战略背后的因素是什么？不同类型防御与病原体的协同演化的数学建模以及防御系统的生物学特征似乎提供了一些线索[87,88]。共模演化模型的详细分析表明，假设一些基本水平的先天免疫，适应性免疫和自杀可以在参数空间的一个相对较小的区域内共存，这两种类型的防御的效力有限[89]。这种情况似乎对应于图1中概述的感测切换电路。4，其中传感器“预测”感染的结果以及免疫系统是否可能成功应对。关于免疫和自杀防御策略的共同演化的这些考虑适用于获得性免疫——指当细胞遇到熟悉的病毒或质粒时占主导地位；-以及针对新来者起作用的先天免疫。
当系统包括涉及免疫和自杀活动的双重功能组件时，免疫-自杀偶联是有利的[89]。这可能是Cas蛋白的情况，例如Cas2，其对于适应性免疫是必需的，但是由于其与干扰素的同源性，也可能显示毒性。此外，虽然含HEPN的Cas蛋白（例如Csm6和Csx1）的生物学功能尚未被很好地理解，但似乎它们也有助于适应性免疫应答的干扰阶段，以及在自毁程序中作为毒素[26，68，70，90]。一个有趣的问题，仍然需要用实验探究在质粒解离后致死后CRISPRCas系统是否仍然可行。
结论
大多数生物，甚至细菌和具有小基因组的古细菌都具有多重抗寄生生物的防御机制，包括影响入侵介导物和自杀机制的免疫机制。这些本质上不同的防御战略的共存，似乎是由免疫系统的效力有限、能够在高度多重感染和其他情况下被快速复制的寄生物攻破而引起的。免疫和自杀策略不仅共存并且经常编码在相同的基因组位点中，而且似乎功能上耦合，特别是借助共享蛋白质组分。有迹象表明（虽然还不是坚实的证据），从免疫模式到自杀模式的防御转换由专门的传感器控制，该传感器判断对细胞造成的损伤水平，并在此基础上“预测”感染的结果。在一些情况下，感测损伤可以是短路的，如VI-A亚型CRISPR-Cas系统所例示的。然而，这样流线型的免疫自杀系统是罕见的，因此暗示上述损伤感测可能是损耗巨大的。免疫与PCD的耦合和细胞死亡的精细控制也能在真核生物中实现，并且似乎在宿主-寄生生物相互作用中是很重要的[93]。因此，免疫和PCD之间的联系，或者换种说法，杀死寄生生物和自杀之间的联系似乎是细胞生命形式的普遍属性。了解耦合机制以及损伤感测的细节——这使得细胞能预测感染的结果，做出明智的生活或死亡决定，是进一步研究的一个重要和令人兴奋的方向。