本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法。
背景技术：
番茄作为一种严格的自花授粉作物，其杂种优势明显，杂种整齐度高、抗逆性强，因此在生产上主要以杂交种为主。目前番茄的杂交制种主要以人工去雄授粉的方式进行。利用雄性不育系作为母本进行杂交种子生产，可省去人工去雄的过程，降低成本，提高杂种种子纯度以及避免亲本流失。因此番茄雄性不育系的选育显得尤为迫切和重要。
技术实现要素：
本发明的目的为选育番茄隐性核雄性不育保持系。
本发明首先保护番茄隐性核雄性不育恢复系的选育方法，可包括如下步骤：
(1)向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；所述番茄隐性核雄性不育系的不育是由于所述花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；
(2)完成步骤(1)后，挑选雄性可育且表达标记蛋白的转基因番茄进行自交，如果某个番茄株系的后代全部雄性可育且表达标记蛋白，则该番茄株系为番茄隐性核雄性不育恢复系。
本发明还保护番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法，可包括如下步骤：向番茄隐性核雄性不育系导入表达花粉育性蛋白的表达盒甲和表达标记蛋白的表达盒乙，获得转基因番茄；所述番茄隐性核雄性不育系的不育是由于所述花粉育性蛋白功能丧失或所述花粉育性蛋白的表达被抑制导致的；
同时满足a1)、a2)和a3)的转基因番茄即为番茄隐性核雄性不育保持系；a1)雄性可育；a2)表达标记蛋白；a3)表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体。
上述任一所述的方法中，所述表达盒甲和所述表达盒乙可以同时导入，也可以分别导入。
上述任一所述的方法中，当所述表达盒甲和所述表达盒乙同时导入时，“向番茄隐性核雄性不育系导入表达盒甲和表达盒乙”可为向番茄隐性核雄性不育系导入重组质粒；所述重组质粒可含有表达盒甲的核苷酸序列和表达盒乙的核苷酸序列。
上述任一所述的方法中，所述表达盒甲和所述表达盒乙均可为单拷贝插入。
上述任一所述的方法中，所述花粉育性蛋白可为solyc03g053130蛋白；所述solyc03g053130蛋白可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列13所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列13所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
上述任一所述的方法中，所述标记蛋白可为ant1蛋白；所述ant1蛋白可为b1)或b2)或b3)：
b1)氨基酸序列是序列表中序列14所示的蛋白质；
b2)在序列表中序列14所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；
b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
上述任一所述的方法中，所述表达盒甲从上游至下游依次可包括启动子、花粉育性蛋白的编码基因。所述启动子可为水稻基因组中solyc03g053130基因的启动子。所述花粉育性蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第1529至3137位所示(1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列)。所述表达盒甲还可包括终止子，所述终止子位于花粉育性蛋白的编码基因的下游。所述终止子的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第3138至4153位所示。所述水稻可为番茄品系m82。
上述任一所述的方法中，所述表达盒乙从上游至下游依次可包括启动子、标记蛋白的编码基因。所述启动子可为35s启动子。所述表达盒乙还可包括终止子，所述终止子位于标记蛋白的编码基因的下游。所述标记蛋白可为紫色标记蛋白(如ant1蛋白)。所述ant1蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。
上述任一所述的方法中，表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体具体可为表达盒甲和表达盒乙插入所述番茄隐性核雄性不育系的同一条染色体的同一位点。
上述任一所述重组质粒具体可为重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3。重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3具体可为将载体pcambia2300-35s-ocs的限制性内切酶kpni和psti之间的dna小片段替换为序列表中序列10所示的dna分子、向限制性内切酶hindiii之间插入序列表中序列1所示的dna分子得到的重组质粒。序列10为紫色标记基因(即ant1基因)的核苷酸序列。序列1中，自5’末端起，第1至1528位为solyc03g053130基因的启动子，第1529至3137位为solyc03g053130基因(1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列)，第3138至4153位为番茄品系m82基因组中solyc03g053130基因的下游序列。
上述任一所述番茄隐性核雄性不育系可为利用crispr/cas9系统对受体番茄基因组中编码solyc03g053130蛋白的基因进行编辑，进而使solyc03g053130蛋白功能丧失或不能表达solyc03g053130蛋白得到的不育系；所述crispr/cas9系统可包括sgrna；所述sgrna的靶序列为序列2所示的dna分子。
上述任一所述番茄隐性核雄性不育系的基因组中编码solyc03g053130蛋白的基因的第1606位均为t。
所述编辑的方法为将向所述受体番茄中导入番茄基因组编辑的载体。所述番茄基因组编辑的载体含有所述sgrna的编码基因和cas9蛋白的编码基因。在本发明的具体实施例中，所述番茄基因组编辑的载体为pkse401-sgrna，其为将序列2所示的dna分子插入pkse401载体的bsai的酶切位点间，且保持pkse401载体的其他序列不变得到的载体。
所述受体番茄可为番茄moneymaker。上述任一所述番茄隐性核雄性不育系可为solyc03g053130纯合突变植株(t0-3-6号单株)，其为将番茄moneymaker的两条同源染色体的solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入了1个胸腺嘧啶(t)，且保持番茄moneymaker的基因组其它序列不变后得到的植株。由于靶点序列为序列1第1601-1619位的反向互补序列，导致其对应的solyc03g053130基因序列在第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(t)，在第一外显子上发生移码突变，突变序列如序列表的序列9所示。
上述任一所述番茄雄性不育系是指番茄植株中花粉皱缩、败育，自交不能正常收获种子，而用其它正常番茄植株的花粉为其授粉可以收获种子。
上述任一所述的方法中，通过番茄的表型即可判断是否表达了标记蛋白。
本发明还保护番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法，可为将上述任一所述方法选育的番茄隐性核雄性不育恢复系和所述番茄隐性核雄性不育系进行杂交，杂交后代即为番茄隐性核雄性不育保持系。
本发明还保护c1)或c2)。
c1)上述任一所述表达盒甲和/或上述任一所述表达盒乙。
c2)上述任一所述重组质粒。
本发明还保护d1)或d2)或d3)。
d1)上述任一所述的方法在番茄育种中的应用也属于本发明的保护范围。
d2)上述任一所述表达盒甲和/或上述任一所述表达盒乙在培育番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系中的应用也属于本发明的保护范围。
d3)上述任一所述重组质粒在培育番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述番茄隐性核雄性不育恢复系和/或番茄隐性核雄性不育保持系的不育系可为上述任一所述所述番茄隐性核雄性不育系。
上述任一所述花粉育性蛋白的表达被抑制具体可为在基因水平上，花粉育性蛋白的编辑基因或rna被抑制。
实验证明，以本发明提供的方法选育的番茄隐性核雄性不育保持系为父本，番茄隐性核雄性不育系为母本进行杂交，获得的杂交后代中，能够表达标记蛋白的株系即为雄性可育的保持系；不能够表达标记蛋白的株系即为不育系。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为solyc03g053130基因的结构图。
图2为实施例1步骤二中2的t0代转基因植物的分子鉴定。
图3为实施例1步骤二中2的t0代转基因植物的突变类型。
图4为实施例1中步骤三的t1代转基因番茄单株的分子鉴定。
图5为solyc03g053130纯合突变植株的测序峰图。
图6为solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力检测。
图7为solyc03g053130纯合突变植株的育性检测。
图8为重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3的结构示意图。
图9为t0代紫色纯合突变植株的花粉活力检测。
图10为t1代紫色纯合突变植株的叶色表型。
图11为t0代紫色纯合突变植株的育性检测。
图12为利用紫色保持系快速筛选雄性不育株的示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。例如分子克隆实验指南(第二版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的培养基如下：
lb液体培养基是将胰蛋白胨(tryptone)、酵母提取物(yeastextract)、氯化钠(nacl)和水混匀得到的培养基，其中，胰蛋白胨在lb液体培养基中的浓度为10g/l、酵母提取物在lb液体培养基中的浓度为5g/l，氯化钠在lb液体培养基中的浓度为10g/l。
ms液体培养基：将4.4gms盐(北京华越洋生物，货号为m519)、30g蔗糖和水混合，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，高压灭菌。
种子生长培养基(1/2ms培养基)：将2.2gms盐、30g蔗糖和水混合，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加入0.8％的琼脂，高压灭菌。
预(共)培养培养基(d1培养基)：将4.4gms、1.0mg玉米素(zeatin)和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。
筛选分化培养基(2z培养基)：将4.4gms盐、2.0mg玉米素、50mg卡那霉素、100mg肌醇、0.5mg叶酸和20g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。
生根培养基：将4.4gms盐、50mg卡那霉素、0.5mg叶酸、0.5mg吲哚丁酸和30g蔗糖溶于水中，用水定容至1l，用1mol/lkoh调ph至5.8～6.0之间，加0.8％的琼脂，高压灭菌。
实施例1、solyc03g053130纯合突变植株的获得
一、构建含solyc03g053130基因特异sgrna靶点的crispr/cas9基因编辑载体
solyc03g053130基因sgrna靶点序列如下：5’-gggaaagaagaaacaagtg-3’(序列2)。
2、合成包含上述sgrna靶点序列的引物对oligo-01f和oligo-r，引物序列如下：
oligo-01f：5’-attggggaaagaagaaacaagtg-3’(序列3)；
oligo-r：5’-aaaccacttgtttcttctttccc-3’(序列4)。
3、将上述引物对oligo-01f和oligo-r退火，并与经过bsai酶切的载体pkse401连接，得到重组载体pkse401-sgrna。将重组载体pkse401-sgrna转化大肠杆菌dh5α，挑选阳性克隆测序，具体步骤参考文献“xing,h.l.，dong,l.，wang,z.p.，zhang,h.y.，han,c.y.，liu,b.，wang,x.c.，andchen,q.j.(2014).acrispr/cas9toolkitformultiplexgenomeeditinginplants.bmcplantbiology14:327.”中的方法。
测序结果表明：重组载体pkse401-sgrna为将序列2所示的dna分子插入pkse401载体的bsai酶切位点间，且保持pkse401载体的其它序列不变得到的载体。
重组载体pkse401-sgrna即为含solyc03g053130基因特异sgrna靶点的crispr/cas9基因编辑载体。
4、挑选测序正确的克隆，提取质粒，并转化根癌农杆菌lba4404(北京华越洋生物，nrr01270)，获得含有重组载体pkse401-sgrna的根癌农杆菌lba4404-c1。
二、针对solyc03g053130进行编辑的t0代转基因植物的获得和分子鉴定
1、针对solyc03g053130进行编辑的t0代转基因植物的获得
(1)转化外植体的准备
挑选饱满、粒大的番茄moneymaker种子，先用40％nacl浸泡20min，再用无菌水冲洗5遍，最后播种于种子生长培养基上，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。种子萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀迅速将子叶切成小方块，将小方块接种于预培养培养基中，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天，得到可用于番茄转化的子叶小方块。
(2)侵染液的准备
将根癌农杆菌lba4404-c1接种于含卡那酶素和利福平的lb液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养，得到培养菌液1。将培养菌液1接种至新的lb液体培养基中(接种比为1:100)，28℃、200rpm培养，得到od600nm值约为0.8的培养菌液2。取培养菌液2，5000rpm离心10min，收集菌体。取菌体，用ms液体培养基重悬，得到od600nm值为0.4的稀释液。
向50ml稀释液中加入50μl浓度为0.074mol/l的乙酰丁香酮溶液，得到侵染液。
(3)外植体的转化、筛选与生根
(3-1)取步骤(1)获得的可用于番茄转化的子叶小方块，浸入步骤(2)制备的侵染液10min。
(3-2)完成步骤(3-1)后，将所述子叶小方块接种于d1培养基上(d1培养基上放无菌滤纸)，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天。
(3-3)完成步骤(3-2)后，将所述子叶小方块转移至2z培养基，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)8周(每2周继代一次)，产生抗性芽。
(3-4)待步骤(3-3)中不定芽伸长至3cm时，用解剖刀将抗性芽切下并转移至生根培养基，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。将生根的t0代转基因植株移入土中常规管理。
将其中5株t0代转基因植株分别命名为1号转基因植物(简称t0-1)、2号转基因植物(简称t0-2)、3号转基因植物(简称t0-3)、5号转基因植物(简称t0-5)和7号转基因植物(简称t0-7)。
2、t0代转基因植物的分子鉴定
(1)提取待测番茄(番茄moneymaker、t0-1、t0-2、t0-3、t0-5或t0-7)叶片的基因组dna。
(2)以步骤(1)得到的待测番茄叶片的基因组dna为模板，采用cas9-f：5’-tcaactgagcaaagacacct-3’(序列5)和cas9-r：5’-ctcgtacagcagagagtgtt-3’(序列6)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
pcr扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环，72℃延伸10min。
(3)将步骤(2)得到的pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
电泳结果见图2(1为t0-1，2为t0-2，3为t0-3，5为t0-5，7为t0-7，wt为番茄moneymaker)。结果表明，番茄moneymaker的pcr扩增产物中无特异条带，t0-1、t0-2、t0-3、t0-5和t0-7的pcr扩增产物中含有一条大小为673bp的条带。由此可见，t0-1、t0-2、t0-3、t0-5和t0-7均含有cas9转基因片段。
(4)以步骤(1)得到的待测番茄叶片的基因组dna为模板，采用c1-f：5’-tctccgaccagttacgtgtgac-3’(序列7)和c1-r：5’-atgcctatcaacgatcctcacat-3’(序列8)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
(5)将步骤(4)得到的pcr扩增产物插入pmd18-t载体，然后转化大肠杆菌dh5α，随机挑选20个阳性克隆测序。
将番茄moneymaker、t0-1、t0-2、t0-3、t0-5和t0-7的测序结果进行比对。部分比对结果见图3(wt为番茄moneymaker)。结果表明，t0-1、t0-2、t0-3、t0-5和t0-7中的目标区段(target)发生多种突变类型。选择在目标区段插入1个碱基的t0-3进行后续分析。
三、solyc03g053130纯合突变植株的获得
1、将t0-3自交，收获t1代转基因番茄种子。将t1代转基因番茄种子播种于苗盘中，培养，得到t1代转基因番茄单株。将其中15个单株依次命名为t1-3-1至t1-3-15。
2、分别提取处于两叶一心期的t1代转基因番茄单株或番茄moneymaker植株的基因组dna。
3、分别以步骤2得到的植株叶片的基因组dna为模板，采用cas9-f和cas9-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
4、将步骤3得到的pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。
电泳结果见图4(wt为番茄moneymaker)。结果表明，t1-3-6、t1-3-8、t1-3-10和t1-3-13均不含有cas9转基因片段。
5、以不含有cas9转基因片段的单株(如t1-3-6、t1-3-8、t1-3-10或t1-3-13)叶片的基因组dna为模板，采用c1-f和c1-r组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。将pcr扩增产物纯化并测序，鉴定出目标区段插入1个碱基的solyc03g053130纯合突变植株(两条同源染色体的solyc03g053130基因发生了相同的突变)，即t1-3-6单株(图5中的突变体t1-3-6)，图中显示为靶点序列插入1个碱基(腺嘌呤a)。由于靶点序列为序列1第1601-1619位的反向互补序列，导致其对应的solyc03g053130基因序列在第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶(t)，在第一外显子上发生移码突变，solyc03g053130基因的突变序列如序列表的序列9所示。
solyc03g053130纯合突变植株(即t1-3-6单株或突变体t1-3-6)为将番茄moneymaker的两条同源染色体的solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入了1个胸腺嘧啶(t)，且保持番茄moneymaker的基因组其它序列不变后得到的植株。
实施例2、solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力和育性检测
一、solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力检测
1、试剂的配置
二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate，fda)母液：将10mgfda溶于5ml丙酮中，分装至1.5ml离心管中，-20℃避光保存。
bkbuffers15mops(ph7.5)缓冲液：将5mlmops(100mm，ph7.5)、7.5g蔗糖、6.35μlca(no3)2(1m)、4.05μlmgso4(1m)和5μlkno3(1m)溶于水中，然后用水定容至50ml。分装至1.5ml离心管中，-20℃避光保存。
2、花粉二乙酸荧光素染色及观察
(1)将1μlfda母液加至1mlbkbuffers15mops缓冲液中，混匀，取1滴至洁净的载玻片上。
(2)用镊子从待测番茄植株(番茄moneymaker植株或solyc03g053130纯合突变植株)的花药中取少量花粉，置于混合液滴上，盖上盖玻片，利用荧光共聚焦显微镜在蓝光(波长495nm)下观察。
检测结果如图6所示(野生型为番茄moneymaker植株，突变体为solyc03g053130纯合突变植株)。从图中可以看出：与番茄moneymaker植株的花粉相比，solyc03g053130纯合突变植株的花粉体积小且皱缩；蓝光下，番茄moneymaker植株的花粉呈绿色，而solyc03g053130纯合突变植株的花粉无染色信号，说明solyc03g053130纯合突变植株的花粉无活力。
二、solyc03g053130纯合突变植株的育性检测
solyc03g053130纯合突变植株无法自交结实。以番茄moneymaker为父本，solyc03g053130纯合突变植株为母本进行杂交，可以获得有活力的f1种子。而以番茄moneymaker为母本，solyc03g053130纯合突变植株为父本进行杂交，无法获得f1种子(图7)。说明solyc03g053130纯合突变植株雄性不育，雌性正常。
实施例3、t0代紫色纯合突变植株的获得
一、构建同时包含育性恢复基因表达盒和紫色标记基因表达盒的重组载体(即重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3)
重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3的结构示意图见图8(p35s为35s启动子，ant1为紫色标记基因，导入ant1基因的植物的植株(如叶片、茎)呈现紫色；plap3-lap3为solyc03g053130基因及其启动子)。
1、以番茄品系la1996叶片的总rna为模板，反转录，得到番茄品系la1996的cdna。
2、以番茄品系la1996的cdna为模板，采用2300-ant1-f：5’-cggggtaccatgaacagtacatctatgtcttca-3’(下划线为限制性内切酶kpni的识别位点)和2300-ant1-r：5’-aactgcagttaatcaagtagattccataagtc-3’(下划线为限制性内切酶psti的识别位点)组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。
3、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶kpni和psti酶切，回收约837bp的dna片段。
4、取载体pcambia2300-35s-ocs(wus，yuz，wangf.2007.cloning，characterization，andtransformationofthephosphoethanolaminen-methyltransferasegene(zmpeamt1)inmaize(zeamaysl.).molbiotechnol36:102-112)，用限制性内切酶kpni和psti酶切，回收约9000bp的载体骨架。
5、将步骤3回收的dna片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到重组质粒pcambia2300-35s-ant1。
6、以番茄品系m82叶片的基因组dna为模板，采用ms45-f6-wf：5’-caatttactgattgtccaagcttgtagatgttcttgtcatgatgac-3’和ms45-r1-wf：5’-gtaaaacgacggccagtgccaagcttgtcattgatatgcatttcaaaactc-3’组成的引物对进行pcr扩增，回收约4153bp的dna片段。
7、采用in-fusionhdcloningkit(clontech)将步骤6回收的dna片段连入重组质粒pcambia2300-35s-ant1的限制性内切酶hindiii的识别位点，得到重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3。
将重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3进行测序。测序结果表明，重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3为将载体pcambia2300-35s-ocs的限制性内切酶kpni和psti之间的dna小片段替换为序列表中序列10所示的dna分子、向限制性内切酶hindiii之间插入序列表中序列1所示的dna分子得到的重组质粒。
序列10为紫色标记基因(即ant1基因)的核苷酸序列。
序列1中，自5’末端起，第1至1528位为solyc03g053130基因的启动子，第1529至3137位为solyc03g053130基因(1529-1920bp为第1外显子序列，2089-2374bp为第2外显子序列，2461-2628bp为第3外显子序列，2737-3137bp为第4外显子序列)，第3138至4153位为番茄品系m82基因组中solyc03g053130基因的下游序列。
重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3表达solyc03g053130蛋白和ant1蛋白。solyc03g053130蛋白的氨基酸序列如序列表中序列13所示。ant1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列14所示。
8、将重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3转化根癌农杆菌lba4404(北京华越洋生物，nrr01270)，获得含有重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3的根癌农杆菌lba4404-b。
二、t0代紫色纯合突变植株的获得
1、t0代转基因植株的获得
以solyc03g053130纯合突变植株为母本，番茄moneymaker为父本，进行杂交，得到杂交一代。将杂交一代进行自交，得到番茄雄性不育系f2群体。
挑选饱满、粒大的番茄雄性不育系f2群体的种子，先用40％nacl浸泡20min，再用无菌水冲洗5遍，最后播种于种子生长培养基上，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)。种子萌发8天后，在无菌条件下用锋利的剪刀迅速将子叶切成小方块，将小方块接种于预培养培养基中，25℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2天，得到可用于番茄转化的子叶小方块。
将根癌农杆菌lba4404-b接种于含卡那酶素和利福平的lb液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养，得到培养菌液1。将培养菌液1接种至新的lb液体培养基中(接种比为1:100)，28℃、200rpm培养，得到od600nm值约为0.8的培养菌液2。取培养菌液2，5000rpm离心10min，收集菌体。取菌体，用ms液体培养基重悬，得到od600nm值为0.4的稀释液。
待测番茄植株分别为solyc03g053130纯合突变植株、番茄moneymaker植株和20株步骤1获得的叶色为紫色的t0代转基因植株。
(1)提取待测番茄植株的基因组dna。
(2)以待测番茄植株的基因组dna为模板，采用cl-jc-f1-1：5’-gccttgaacttccggtatggactagc-3’(序列11)和cl-jc-r1-1：5’-ttcttgtctccatgccaactttccatg-3’(序列12)组成的引物对进行pcr扩增，得到约1845bppcr扩增产物。然后用cl-jc-r1-1对pcr扩增产物进行测序。
pcr扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，35个循环，72℃延伸10min。
(3)将20株t0代转基因植株的测序结果分别和番茄moneymaker植株的测序结果进行比对。选取两条同源染色体上的solyc03g053130基因第1605位和第1606位之间插入1个胸腺嘧啶的纯合突变植株进行后续分析。
最终鉴定到5株solyc03g053130纯合突变且叶色为紫色的t0代转基因植物(即t0代紫色纯合突变植株)，分别命名为t0-1-1、t0-2-2、t0-3-3、t0-4-4和t0-5-5。
实施例4、t0代紫色纯合突变植株的花粉活力及t1代紫色纯合突变植株的叶色表型和育性检测
一、t0代紫色纯合突变植株的花粉活力检测
(2)用镊子从待测番茄植株(solyc03g053130纯合突变植株、番茄moneymaker植株、t0-1-1、t0-2-2、t0-3-3、t0-4-4或t0-5-5)的花药中取少量花粉，置于混合液滴上，盖上盖玻片，利用荧光共聚焦显微镜在蓝光(波长495nm)下观察。
部分检测结果如图9所示(1为番茄moneymaker植株，2为solyc03g053130纯合突变植株，3为t0-3-3，4为t0-5-5)。结果表明，与番茄moneymaker植株的花粉相比，solyc03g053130纯合突变植株的花粉体积小且皱缩；蓝光下，番茄moneymaker植株的花粉呈绿色，而solyc03g053130纯合突变植株的花粉无染色信号，说明solyc03g053130纯合突变植株的花粉无活力。相比而言，t0-1-1、t0-2-2、t0-3-3、t0-4-4和t0-5-5的花粉活力与番茄moneymaker植株的花粉没有差异。由此可见，重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3的导入恢复了solyc03g053130纯合突变植株的花粉活力。
二、t1代紫色纯合突变植株的叶色表型和育性检测
1、将t0-1-1自交，得到t1-1-1种子。将t0-2-2自交，得到t1-2-2种子。将t0-3-3自交，得到t1-3-3种子。将t0-4-4自交，得到t1-4-4种子。将t0-5-5自交，得到t1-5-5种子。取常规培养生长4周的待测番茄植株(solyc03g053130纯合突变植株、番茄moneymaker植株、t1-1-1、t1-2-2、t1-3-3、t1-4-4或t1-5-5)，观察叶色表型。
部分结果见图10(1为番茄moneymaker植株，2为solyc03g053130纯合突变植株，3为t1-3-3，4为t1-5-5)。结果表明，番茄moneymaker植株和solyc03g053130纯合突变植株的叶色为绿色，t1-1-1、t1-2-2、t1-3-3、t1-4-4和t1-5-5的叶色为紫色。
2、将待测番茄植株(solyc03g053130纯合突变植株、番茄moneymaker植株、t0-1-1、t0-2-2、t0-3-3、t0-4-4或t0-5-5)进行自交，观察。
部分结果见图11(1为番茄moneymaker植株，2为t0-3-3，3为t0-5-5)。结果表明，番茄moneymaker植株、t0-1-1、t0-2-2、t0-3-3、t0-4-4和t0-5-5均可以自交结实；solyc03g053130纯合突变植株无法自交结实。
上述结果表明，重组质粒pcambia2300-p35s-ant1-plap3-lap3的导入恢复了solyc03g053130纯合突变植株的雄性育性。
实施例5、紫色保持系的制备
1、将t0-1-1自交，得到t1-1-1种子。将t0-2-2自交，得到t1-2-2种子。将t0-3-3自交，得到t1-3-3种子。将t0-4-4自交，得到t1-4-4种子。将t0-5-5自交，得到t1-5-5种子。
2、将50粒t1代转基因番茄种子(t1-1-1种子、t1-2-2种子、t1-3-3种子、t1-4-4种子或t1-5-5种子)播种于苗盘中，培养，1月苗龄期观测叶色表型。如果叶色为紫色的植株数和叶色为绿色的植株数约为3:1，则相应的t0代紫色纯合突变植株为单拷贝插入。
结果表明，t1-3-3种子和t1-4-4种子获得的植株(分别命名为t1-3-3植株和t1-4-4植株)中，叶色为紫色的植株数和叶色为绿色的植株数约为3:1。因此，t0-3-3和t0-4-4均为转基因插入单拷贝的株系。
3、取t1-3-3中叶色为紫色的植株，继续自交，得到t2-3-3种子。取t1-4-4中叶色为紫色的植株，继续自交，得到t2-4-4种子。
4、将50粒t2代转基因番茄种子(t2-3-3种子或t2-4-4种子)播种于苗盘中，培养，1月苗龄期观测叶色表型。如果苗盘中的植物叶色均为紫色，则苗盘中的植物即为纯合恢复系转基因植物。
5、将纯合恢复系转基因植物和solyc03g053130纯合突变植株(即solyc03g053130纯合突变不育系)杂交，杂交后代即为solyc03g053130纯合突变不育系的紫色保持系。
6、以紫色保持系为父本，solyc03g053130纯合突变不育系为母本，杂交，得到杂交f1代。将杂交f1代的种子播种于苗盘中，培养，1月苗龄期观测叶色表型。其中叶色为紫色的为紫色保持系，叶色为绿色的为非转基因的雄性不育系(与solyc03g053130纯合突变不育系完全一致)。
利用紫色保持系快速筛选雄性不育株(即solyc03g053130纯合突变不育系)的示意图见图12。
<110>北京市农林科学院中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一种番茄隐性核雄性不育保持系的选育方法
<160>14
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