CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

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CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

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目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。来自华中农业大学,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室等处的研究人员发表综述，重点对16款sgRNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述……

生物通报道：基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sgRNA(SmallguideRNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。

目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。来自华中农业大学,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室等处的研究人员发表综述，重点对16款sgRNA设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sgRNA进行了归纳总结。

基于CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)/Cas9系统介导的基因组编辑技术，是继锌指核酸酶(Zinc-fingernucleases,ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)后的第三代基因组编辑技术，主要是源于对细菌的获得性免疫系统改造而成。一经问世，在食蟹猴(Cynomolgusmonkey)、小鼠(Musmusculus)、大鼠(Rattusnorveaicus)、斑马鱼(Zebrafish)、猪(Susscrofa)、拟南芥(Arabidopsisthaliala)、烟草(Nicotianatabacum)、高粱(Sorghumbicolor)和水稻(Oryzasativa)等多个物种中实现了基因组编辑。

CRISPR/Cas9技术主要由两部分组成：一是sgRNA，通过碱基互补配对与基因组特异结合；其次是Cas9核酸酶，可靶定到具有下游前间区序列邻近基序(Protospaceradjacentmotif,PAM)的特定基因组序列并进行切割。目前，CRISPR/Cas9技术依然在不断改进中。如何改善和提高基因组编辑效率，同时最大限度降低脱靶风险成为亟待解决的问题，这篇围绕这一核心问题进行了综述，并重点介绍了sgRNA的设计要点。

作者指出，利用CRISPR/Cas9技术关键的两个问题是：如何提高CRISPR/Cas9技术基因组编辑效率？如何最大限度降低脱靶风险？影响基因组编辑效率和特异性的因素很多。目前业界对CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑效率和脱靶效应研究尚不够深入，观点还不统一。这反映在不同sgRNA设计与脱靶预测软件中，对sgRNA的活性和特异性评估标准不一致。

比如“CRISPRDesign”软件对脱靶位点最大仅考虑4个碱基错配，未考虑种子序列的特异性。而sgRNAcas9软件允许脱靶位点最大含5个碱基错配，还考察了长度为12bp的种子序列。CRISPRdirect和COSMID软件将脱靶位点是否存在碱基插入与缺失纳入评估范围，Off-Spotter软件允许自定义种子序列位置和长度。E-CRISP软件还评估sgRNA与脱靶位点的二级结构及基因组位置等。

目前很多软件并未对预测的脱靶位点进行验证，因而无法比较不同软件评估脱靶效应算法灵敏度高低。sgRNA和PAM类型影响基因组编辑效率和特异性，而不同sgRNA活性和特异性有差异。因此，选择sgRNA需慎重。选择高效且特异的sgRNA需要注意的因素有：

(1)sgRNA的长度为17~20nt；(2)可选3'末端含GG的sgRNA，避免使用含“TTTT”转录终止序列的sgRNA，GC%含量为40%~60%；(3)如果构建U6或T7启动子驱动的sgRNA表达载体，为提高转录效率，可限定sgRNA的5'末端为G或GG；(4)如需造成基因移码突变，尽量选择在功能域或编码区内部设计sgRNA；(5)检查sgRNA靶标位点基因组序列是否存在SNPs；(6)针对Cas9单切口酶设计“paired-gRNA”，需限定两个sgRNA之间的距离，建议为–2~32nt；(7)分析脱靶位点可限定最大允许5个碱基错配，并同时评估种子序列的特异性。另外还可评估是否存在碱基插入或缺失。

（生物通）

原文检索：

谢胜松,张懿,张利生,李广磊,赵长志,倪攀,赵书红.CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估[J].遗传,2015,37(11):1125-1136.ShengsongXie,YiZhang,LishengZhang,GuangleiLi,ChangzhiZhao,PanNi,ShuhongZhao.sgRNAdesignfortheCRISPR/Cas9systemandevaluationofitsoff-targeteffects.HEREDITAS(Beijing),2015,37(11):1125-1136.

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