利用CRISPR相关转座酶实现大片段基因敲入CRISPRCASTDNA基因组基因细胞

作者开发了一种使用TypeI-FCAST在人类细胞基因组中整合大片段DNA序列的方法，该方法避免了DSB的产生，也规避了同类技术的缺点，未来的改进将集中于提高基因整合的效率和精度。

十年前，CRISPR-Cas系统正式进入大众视野，现在，这种RNA引导的DNA编程系统已经在基础研究、农业应用和疾病治疗中得到广泛应用[1]。在哺乳动物细胞中，CRISPR-Cas9介导的双链断裂（DSB）主要有两种修复方式——非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR），而且NHEJ的效率通常超过HDR至少一个数量级[2]；虽然科学家们努力利用不同的方法增强HDR效率来实现精准编辑，但对于基因组中大片段DNA的精确增删仍然效率低下且难以生成[3]，而伴随的大规模基因组缺失、染色体易位和染色体破碎等副作用也成为阻碍基因编辑发展的绊脚石[4]。

基于CRISPR-Cas系统新型基因编辑工具，包括碱基编辑器（Baseeditor）和先导编辑器（Primeeditor），利用失活的dCas9（或nCas9）实现基因组的精准定位，同时利用融合的效应蛋白在特定位点发生所需的化学反应，从而实现精确的、不依赖于DSB的DNA序列改变[2]。然而，这两种方法的高效编辑范围一般为从单碱基到~50个碱基对（bp），而无法实现大片段的整合。最近开发的将先导编辑器与丝氨酸整合酶相结合的工具，如TwinPE和PASTE，已被证明能够插入更大的DNA，效率高达~25%，但这些方法需要在基因组整合位点发生多步有序的编辑事件，所以复杂DNA中间体的产生、各步反应的效率和顺序是否能协调一致，依然是亟待解决的问题[5-6]。

源自霍乱弧菌的TypeI-FCAST系统包含TniQ和级联复合物（VchQCascade），TnsC,TnsA-TnsB异源二聚体，以及作为向导的crRNA（gRNA）。作者首先需要验证这些细菌蛋白和向导RNA是否可以在哺乳动物细胞内有效表达。通过将每个蛋白编码基因克隆到具有N端或C端核定位信号（NLS）和3×FLAG表位标签的表达载体上，无论是单独转染还是所有CAST蛋白共同转染，WB的结果均显示CAST系统蛋白的高效表达。之后，作者利用之前开发的方法，监测GFP编码mRNA的5’非翻译区（UTR）内的crRNA生物发生，从而单独评估了向导RNA的表达。作者将此系统命名为eCAST-1。

图1.CAST系统在人类细胞中的表达

与大多数II型和V型CRISPR-Cas系统编码的单个效应蛋白组成的DNA核酸酶（如Cas9和Cas12）不同，I型系统编码的级联复合体不具有DNA切割活性，反而类似于dCas9只具有结合DNA的功能；于是作者通过将转录激活因子与QCascade融合来构建新型转录激活系统，并在细胞内实现报告基因的转录激活。接着，作者根据先前的发现——TnsC可以形成ATP依赖性寡聚体，并被特异性招募到结合DNA的QCascade，假设可以利用TnsC多价组装的特性，以增加哺乳动物细胞中转录激活的效力，于是将VP64融合到TnsC的N端或C端，靶向报告基因位点，发现TnsC-VP64激活剂比单独的QCascade驱动更高水平的转录激活。

图2.基于QCascade和TnsC的转录激活工具

图3.在细胞内筛选高活性的CAST系统

图4.ClpX增强基因组整合效率

总之，作者开发了一种使用TypeI-FCAST在人类细胞基因组中整合大片段DNA序列的方法，该方法避免了DSB的产生，也规避了同类技术的缺点，未来的改进将集中于提高基因整合的效率和精度。

不感兴趣

看过了

取消

人点赞

人收藏

打赏

我有话说

0/500

同步到新浪微博

您的申请提交成功

您已认证成功，可享专属会员优惠，买1年送3个月！开通会员，资料、课程、直播、报告等海量内容免费看！