4、.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris
5、碱制备，再用HCL调节PH值,而不用Tris.CLo5、TEMED原溶液N，N，NN四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS加样缓冲液:pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml,H2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ui，总蛋白量mg7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3g
6、Tris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。9、丽春红染液储存液：丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、脱脂奶粉5%(w/v)。11、NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris
7、/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)o16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)o17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)o18、100mmol/LNaClo19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTAo(可以参看分子克隆)四、主要步骤主要包括以下4个基本步骤样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品
9、在振荡器上混匀415min，14000g离心15min(4C)，弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。注意：一般上样2030g已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100g，但电泳条带易拖尾,可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离(参照SDS电泳方法)转膜杂交膜的选择是决定Westernblot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Westernblot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC
10、)和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用045m和02m两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用045m的膜，小于20kD的蛋白就要用02m的膜了，如用045m的膜就会发生Blothrough的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和
11、1-5秒钟。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。将胶浸于转移缓冲液中平衡1Omin。注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。装配转移三明治：海绵3层滤纸胶膜3层滤纸海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，10OV,1h（电流约为0.3A）。注意：应再次检
12、查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜免疫杂交与显色1.用25mlTBS洗膜5min，室温，摇动。2置膜于25ml封闭缓冲液中1h,室温，摇动。15mlTBS/T洗3次（5min/T）。加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4C过夜，缓慢摇动。15mlTBS/T洗3次（5min/T）。加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h,缓慢摇动。15mlTBS/T洗3次（5min/T）。15mlTBS洗1次。9.蛋白检测（显色法或发光法，按相应试剂说明操作）。注意事项：1操作中戴手套，不要用手触膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡时
13、间不要超过5秒。3如检测小于20kD的蛋白应用0.2m的膜，并可省略转移时的平衡步骤。4.某些抗原和抗体可被Tween-20洗脱，此时可用1.0%BSA代替Tween-20。5关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBSorPBS:能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.33%BSAinPBS:低的内源性交叉反应性。6.如用0.1%Tween20、0.02%NaN3PBSorTBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。五、实验常见的问题指南根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：1.参考书推荐对初学者看什
14、么资料比较好？解答：抗体技术实验指南和Antibodies（alaboratorymanual，wrotebyEdHarlow，davidlane）两本书不错。针对样品的常见问题做线粒体膜UCP2蛋白的WesternBlot（以下简写成WesternBlot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120，换了个santacloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WesternBlot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂
16、60kd的，SDS电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作WesternBlot吗？解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6%,StackingGel3.5%。如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的combo蛋白变性后可以存放多久？解答：一80C,两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）。我所测
17、定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11%的配方，不知为何？解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用BSA代替应该好一点.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答：WesternBlot
20、速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripabuffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做WesternBlot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的WesternBlot则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过（抑Pmg/mm2一抗，二抗的比例是否重要？解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特
23、于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）W.WesternBlot中抗体的重复应用问题解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用23次。稀释后应在23天内使用，4度保存，避免反复冻融。4.滤纸、胶和膜的问题NC膜PVDF膜尼龙膜怎样鉴别？解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF
24、膜介于二者之间。就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480002，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达801002，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达1253002。就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能
27、求。HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极滤纸胶膜滤纸。滤纸的长宽分别比胶小12mm，而膜的长宽分别比胶大12mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。JJ.蛋白
30、作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.m和0.2m两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如果用0.m的膜就会发生“Blowthrogh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合
31、的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150g/cm2。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素
32、膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE(二乙氨乙基)修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为
35、到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体(Anti-V5-HRP)o但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！解答：1、我用的是RochemolecularBiochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做WesternBlot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。有的时候,PrestainedMarker放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问
40、没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD-分子量67kd,提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本-20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液,TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找原因。1.封闭液用5%Milk，漂洗液(washingbuffer用TBST)2.看看一抗是否能wo
41、rk，降到1：20。3.看看二抗是否有问题。YY.加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。ZZ.转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),Dissolve8.8gofNaCl，0.2gofKCl，and3gofTrisbasein800mlofdistilledH2O,Add500ulofTween-20,AdjustthepHto7.4withH
43、得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解缓冲液（Tris.HCl，50mmol/L，pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1mmol/L;PMSF，1mmol/L;Leupeptin，2g/ml）不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制剂？解答：做2-D绝对不推荐使用NP-40（因为即使进口的NP40也不纯，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素+2M硫脲+4%CHAPS构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白
44、酶的活性，2M硫脲+4%CHAPS对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。EDTA用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做WB无所谓，做MAILDI时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质（在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸）；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。METHOD2（50ml总量）：？-mercaptoet
45、hanol342l；20%SDS5ml；Tris-ClpH6.73.125ml；力口ddH20至50ml。方法：将用过的膜浸入strippingbuffer中，置50C水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。METHOD31、beta-metaptoethanol35ul2、10%SDS1ml3、tris（0.5M，pH6.7）625ul4、dH2O3.34ml50-55C,30min。METHOD4strippingbuffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配毕竟，加了-m
46、ercaptoethanol以后太难闻了，配了就用；而且，有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很方便的。每次用量5ml少了点,我每次用50ml。METHOD50.5MNaCl，0.5MHAc；室温摇床15min。METHOD6将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗（同第一次发光），实践证明方法完全可行。不管用那种方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。9.条件的摸索DDD.用的是SantaCruz的抗体，也实验过一抗和二抗肯定能结合，二抗加DAB肯定能显色。电泳的胶用考马斯亮蓝染色没问题，但是不知道与Marker对应的条带是否
47、是我要的（我目的蛋白的分子量分别是55KD、29KD）。半干法2小时转膜后，丽春红染色发现大分子量蛋白转过去的较少。难道是裂解液出了问题？我用的是三去污剂，但没加叠氮钠和大概叫Apoptin的那种蛋白酶抑制剂。冰上裂解-80度冻存的细胞，4度12000g离心5分钟，取上清，与分子克隆（第二版）上的加样buffer混合，沸水变性5分钟，上样。不知道是哪里出了问题？解答：建议：1、首先确定您提的蛋白质量如何？可用PIERCE公司的BCA试剂盒测蛋白的浓度，一般来讲，其浓度应该在几-20微克/微升。2、若是蛋白没问题，哪就看是不是电泳的问题，首先要看胶的浓度，您目的蛋白的分子量分别是55KD、29K
50、系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。就转膜时，是采取恒压还是恒流的问题，我想和大家探讨一下，我感觉我这个系统用恒流很容易烧胶，我的胶有68cm2，用50mA恒流来转膜，刚开始电压就很高，有20v左右，而用恒压，开始电流有110mA，但15min后，电流就降到80mA，30min后就稳定在40mA，不就相当于恒流吗？解答：恒流时电压逐渐升高的原因是湿滤纸逐渐变干因而电阻逐渐增大的缘故，如果电压升得太快，可以使滤纸更湿一些以克服。就我的感觉，20V的电流30min以后20Kd以下的分子丢失很多，不过我用的是小胶40cm2，不知有无不同。GGG.我想尽量提高转膜的效率（我的
52、VDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。III.1、煮好后的样品，若没有及时上样分离，应如何保存，可以保存多久？2、有没有人在用bio-rad的小型垂直电泳槽，有没有操作手册？3、湿式转移时是否必须要用bio-rad的专用滤纸？4、恒压转移的条件如何确定，因为我要分离小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白质，转移条件能够相同吗？5、凝胶的浓度是不是可以用一个浓度？书上写不同的凝胶浓度分离的分子量范围不同，还给出了一个线形范围，是不是不在这个范围内也能分离，只是就不是线性范围了？解答：1、煮好后的样品，放到-20，我们在一个月后此样品，效果一样。2、bio-rad的小型垂直电泳槽的
58、RRR.做WesternBlot实验时，发现转膜时的电流总是偏小，转膜的效率也偏低.100V恒压转膜时的电流只有190mA左右，而以前都有250mA。体系和条件都和以前一样，只是环境温度比以前低了很多。解答：有可能重复使用了转移缓冲液，随着离子的逐渐减少，电阻越来越大，当然恒压时电流越来越小了建议更换转移缓冲液。反复使用不要超过三次。环境温度低是有利于转移的。SSS.我电泳用的是恒流，一块胶，20mA，100分钟左右。转膜也是恒流，38mA，100分钟。而且我用别人的细胞和一抗在我的整个反应体系下做出来了，当然彼此的目的蛋白不同。所以，我想问题应该出在抗原和一抗上，不知对不对。一抗我买的是单抗
59、，推荐的稀释度是1：1001：1000。我用的是1：100。难道非要用多抗吗？按道理单抗也应该出条带呀！细胞用三去污剂裂解的，没有做定量，加巯基乙醇变性后，每孔上样20微升。提出的蛋白我保存在4度了，这样行吗？解答：1、建议您用恒压进行电泳，先用70V，等跑过积层胶与分离胶的界限时，换用90-100V，再跑3小时左右。2、转膜可用恒流，但要根据你的膜的面积及所要检测的蛋白的分子量的大小来确定电流的大小，一般来讲，0.8-3.0mA/CM2，分子量大的蛋白就用的电流大些，譬如，你膜的面积是30CM2，蛋白的分子量是80KD，那么你就可以以2.0mA/CM2的条件进行，你就可以60mA的电流进行。
60、3、我觉得你的抗体应该没问题。4、你提出的蛋白怎么保存在4度呢？我们实验事都是保存在-20度的，提出蛋白分装保存在-20度。TTT.目的蛋白是一种6KD的分泌性蛋白，RT-PCR就显示细胞中mRNA表达不高，估计将培养上清冻干浓缩后采用WesternBlot还可能检测不出，但如果用western，是否一定要用0.2m的膜？用Tris-tricineSDS电泳，电泳时分别管制三层凝胶，分离胶用40%T丙稀酰胺（2.6%C）浓度为16.5%，另外两层都用30%丙稀酰胺，中间一层浓度为10%，积层胶浓度为4%，凝胶厚度1mm，转膜的条件试过30V70分钟，膜上可见到小分子蛋白marker的条带，似乎