我们的研究提供了更好地了解其他MAMP受体对在植物在低等和高等后生动物中分子进化的一个理论基础。
编译：微科盟R.A，编辑：微科盟茗溪、江舜尧。
本研究的目标是：通过深度突变谱来解构Paflg22的免疫原性和运动性特征，以确定诱导AP的表位氨基酸谱。本研究中，作者通过共同利用合成生物学和定向进化方法合并为一种方法来解决这问题。作者使用来自铜绿假单胞菌Pa的flg22肽(简称Paflg22)作为参考肽来进行了研究。作者首先确定了突变对运动的影响。接下来，作者阐明了FLS2-flg22相互作用的原理，从而阐明了其免疫原性。作者发现了两个不同的突变轨迹，它们依赖不同的机制来避免FLS2检测。一条轨迹是通过减少与FLS2的相互作用而导致激动剂功能的丧失，产生作为FLS2拮抗剂的功能增强表位。最后，作者对当前细菌序列数据库中主要表位的计算分析表明，这些合成轨迹所导致的变化在自然界中是存在的。
最终，作者解释了：鞭毛蛋白表位的免疫原性和运动性特征，并确定了驱动AP的氨基酸突变谱。作者发现了两个合成突变轨迹，它们破坏了植物鞭毛蛋白受体的检测活动。这些轨迹产生具有拮抗剂或较弱激动剂活性的表位。最后，作者发现这些轨道的特征在天然假单胞菌中叠加存在。
图文摘要
论文ID
原名：Signaturesofantagonisticpleiotropyinabacterialflagellinepitope
译名：一种细菌鞭毛蛋白表位的拮抗多效性（antagonisticpleiotropy）特征
期刊：CellHost&Microbe
IF：21.023
通讯作者：CorbinD.Jones；JefferyL.Dangl；YoussefBelkhadir
通讯作者单位：北卡罗来纳大学教堂山分校；奥地利科学院GregorMendel研究所
DOI号：10.1016/j.chom.2021.02.008
实验设计
结果
为了确定flg22的氨基酸序列对鞭毛蛋白功能的影响程度，我们构建了一个突变菌株库(Paflg22)，表达了假单胞菌Pa中flg22结构域的几乎所有可能的单错义突变。为此，我们通过靶向所有Paflg22密码子以替换为指定每个其他氨基酸的密码子来生成412个fliC等位基因克隆（图1A）。接下来，我们构建了一个PafliC突变体(PaΔfliC)，并将我们突变体纲要的每个单独克隆转化为这个非运动性菌株，以测试其运动性回补（图1A、1B和S1A）。为了消除假阴性，我们确证鞭毛蛋白在所有转化体中表达（图S1B）。只有18.7%的菌株显示出与野生型fliC转化体完全相同的运动性表型（图S1C）。虽然45%的转化子运动性显著降低，但34.8%的转化子没有运动性，类似于PaΔfliC（图S1C）。因此，我们深度突变谱中的绝大多数突变都会对Pa的运动性产生负面影响（图1C）。相比之下，只有少数突变增强了Pa运动性（图1D）。
图2.flg22的深度突变谱确定了控制与FLS2相互作用的氨基酸序列（A）全长突变谱得到的FLS2ECD和flg22肽之间相互作用分数的分布。根据四分位区间（IQR）分析，flg22肽与FLS2ECD的相互作用更强烈（紫色），类似（白色），或更弱（绿色）。相互作用得分>3.12或者得分<2.86被定为与所有其他显著不同(B和C）flg22序列标识映射FLS2相互作用分数。降低或增强flg22-FLS2ECD相互作用强度的氨基酸突变分别以绿色或紫色突出标示。小写字母表示相互作用作用减少或改善。地址/信息段和氨基酸位点分别标示在顶部和底部(D和E）位点特异性评分矩阵热图，表示每个氨基酸变化对flg22-FLS2ECD相互作用的影响。产生flg22突变体的突变与FLS2相互作用分数低于（D）或高于（E）野生型Paflg22的IQR分别用绿色或紫色表示。白色表示相互作用分数分布在Paflg22IQR中的变体(F）条形图，表示用相同氨基酸替换所有flg22位点所得到的相互作用分数之和如(G）,（F）所示，但对于每个氨基酸位点的所有替换。对于（F）和（G），显著降低或提高相互作用作用分数的替换分别用绿色或紫色标示。
然后，我们利用获得的数据集，绘制了所有程序化氨基酸替换对flg22-FLS2ECD相互作用的个体影响图谱（图2B-2G）。用带正电荷或负电荷的氨基酸替换“信息”片段的任何残基的突变，分别减少或增加了flg22-FLS2ECD相互作用（图2B-2G）。类似地，用Lys13交换带负电荷的氨基酸增强了与FLS2ECD的相互作用（图2E和2F）。因此，表位的地址和信息片段的局部静电电荷可以促进或破坏与FLS2的相互作用（图2G）。我们的分析显示，Asp14和Asp15（简称Asp14/15）与肽长度无关，它是与FLS2ECD相互作用的”位点”（address）片段的最关键残基（图S2F）。我们的发现与结构和功能研究的结果相一致。尽管其他残基具有高度保守性，但拟南芥FLS2受体还是极其精确地聚焦于表位的Asp14/15残基，这可能是因为该双链对在鞭毛蛋白flg22结构域中定义螺旋-环-螺旋转换的边界非常重要（图1F）。
接下来，我们预测：如果选择压力引起拮抗作用来微调细菌的运动和/或与FLS2的相互作用，我们应该能够检测到它们的分子足迹。为此，我们根据各自表位的相互作用得分，将我们收集的每个细菌突变株分配到我们之前定义的三个相互作用亚群中的一个（图2A）。然后我们分析了各组的运动性，发现相互作用亚组之间的密度分布没有显著差异（图3A）。然后，我们比较了每个残基对运动性和与FLS2相互作用的个体贡献（图S3A）。我们发现不变或高度保守的残基Leu3、Gly6和Ala16/17的突变保留在与FLS2相互作用的野生型水平，同时对运动性产生严重影响（图S3A）。第二组进化保守残基对运动性维持或FLS2相互作用均未显示出整体不利影响（图1C和S3A）。因此，进化保守性不是FLS2检测拟南芥鞭毛蛋白表位的唯一标准。
图3.拮抗多效性限制了非免疫原性（non-immunogenic）flg22表位的进化（A）散点图，表示Pa转化子（x轴）和flg22-FLS2相互作用分数（y轴）之间的关系。每个转化子根据Paflg22IQR被分配到一个相互作用的亚群，并相应地进行着色。边距表示相互作用子组颜色编码的密度分布。各亚组的密度分布无统计学差异（Kolmogorov-Smirnov检验，KS>0.6）(B)用Asp14/15替代赖氨酸会破坏Ps的泳动能力。顶部图片显示PsΔfliC菌株的运动表型，辅之以空载体(EV)或fliC变异体编码flg22D14K或编码flg22D14K或flg22D15K表位的fliC变体回补fliC菌株。比例尺：0.5cm。下图：指定Ps菌株泳动的量化。具有相同字母的基因型在>95%的置信度下是不可区分的（所有两两比较均采用单因素方差分析，其次是Tukey的HSD；P<0.05)。生物独立观察数（n）标示在图表顶部(C）GCI推导的FLS2/flg22相互作用动力学。所示为传感器图，数据为橙色（Paflg22）或绿色（flg22D14K/flg22D15K），相应的配合用黑色覆盖。nd：未确定。
接下来，我们评估了通过深度序列/相互作用突变谱鉴定的突变表位的免疫原性功能。为此，除flg22D14K和flg22D15K外，我们选择了均匀覆盖FLS2相互作用得分分布两端的表位衍生物（图S4A级；数据S2和S3）。共有44种合成肽，包括10种属于显著增强相互作用（SEI）组的变体，随后进行了测试，并与野生型和fls2突变植物中Paflg22的免疫原性反应进行了系统比较（图4A和S4B–S4F）。我们所有的分析也包括不活跃的Paflg20肽作为额外的阴性对照。我们使用flg22诱导的活性氧（ROS）和幼苗生长抑制（SGI）测定来测量FLS2的激活，发现免疫信号在很大程度上取决于与FLS2的相互作用（图4A和S4B–S4F）。虽然少数突变体引发的反应稍强或稍弱，但大多数与Paflg22相互作用的突变体都诱发了类似的免疫反应。只有flg22Q20C发现具有与其免疫原性活性相对应的相互作用评分，因此被视为异常值(图S4G-S4K)。我们发现SEI组的抗原决定簇没有超过Paflg22诱导的反应(图4A、S4C、S4D和S4F)。事实上，其中4个突变体显示类似于flg20的反应(图4A和S4B-S4F)。因此，我们使用GCI验证了这些变量与fls2的相互作用(图S4L;数据S4)。
图4.将FLS2相互作用从激活中解偶联作为产生非免疫原性（non-immunogenic）flg22表位策略（a）flg22诱导的幼苗生长抑制（SGI）。生物独立观察（n）标示在图表顶部。所测试的flg22肽标示在底部。通过增加与FLS2的相互作用分数，肽从左到右排列。使用线性混合模型（双侧t检验，然后使用Holm方法进行多重检验校正）评估统计显著性；P<0.05).（B）防御标记基因MYB51在表位处理下的根系表达模式。显示的是来自单个共焦截面的图像。表位标示在每个面板的顶部。flg22显示的比例尺为50μm适用于所有图片(C）用底部所示的flg22肽衍生物处理后mVENUS信号强度的定量分析。生物独立观察数（n）标示在图表顶部。表示统计显著性（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验；P<0.05).
为了进一步证实这些结果，我们使用免疫标记基因表达的实时成像，并使用两组荧光转录报告系（图4B、4C、S4M和S4N）监测子叶和根的表皮细胞中的FLS2反应。与我们之前的结果一致的是，flg22D14K和flg22D15K在这些分析中没有活性（图4B和4C）。flg22I21D、flg22Q20D、flg22I21E和flg22G18F在这些分析中再次被证明是非免疫原性（non-immunogenic），而所有其他SEI肽在两种细胞类型中显示出与Paflg22几乎相等的应答（图4B、4C、S4M和S4N）。与flg22K13D相比，flg22K13D在根和子叶中均诱导应答，flg22K13Y仅在子叶细胞中诱导应答（图S4M和S4N）。因此，拟南芥中FLS2对多态表位的反应是细胞类型依赖性的。总之，我们的结果表明，与FLS2的相互作用和激活是可以解耦的。这些发现与共同flg22表位中自然多态性介导的FLS2反应的解偶联一致。我们认为微生物可以利用这种功能性的解偶联来规避AP对Asp14/15残基的压力。
图5.flg22信息片段中拮抗多效性的可调性影响FLS2-BAK1相互作用并提供宿主定植优势；(A和B）Pa（A)和Ps（B）ΔfliC菌株的泳动定量，这些菌株用EV或编码fliC的Paflg22突变体或niSEIflg22突变体转化。具有相同字母的基因型在>95%的置信度下无法区分（单向方差分析，然后是Tukey-HSD分析，用于所有成对比较；P<0.05）。(C）使用酶联免疫吸附测定法在体外测量FLS2-BAK1异源复合物的形成。表示的是2h内的相对吸光度（A650nm)。对于（A-C），独立观察的数量（n）显示在每个图的顶部。(D）用EV或用fliC变体编码或flg22Q20D转化的PsΔfliC菌株在顶部所示。将第0天和第3天的每片叶子面积的细菌数量（cfu/mL)取log10，并进行了标注。点代表来自两个独立实验的个体观察结果。n=样品数量，显示在底部（来自4个植物/样品的8个叶盘）。(E）使用上述细菌菌株和植物基因型量化叶病症状。对于（C-E）*表示统计显著性（单向方差分析，然后是Dunnett（C）或Sidak（D和E）多重比较检验；P<0.05）。(F)接种上述细菌菌株后5拍摄的叶子的代表性图片。植物基因型标注在了图的顶部。比例尺：1cm。
接下来，我们在使用GCI的体外结合动力学，并确定所有niSEI肽诱导不稳定的FLS2-BAK1复合物（图6A和S6A；数据S4）。我们确认了这些结果通过使用共免疫沉淀分析（图6B）。FLS2/BAK1相互作用导致胞浆激酶BOTRYTIS诱导激酶1（BIK1）的磷酸化，用于下游信号传导。niSEI肽均未诱导BIK1磷酸化（图S6B）。意外的是，在体外flg22A22E触发BIK1磷酸化而不诱导FLS2-BAK1相互作用（图6B和S6B）。因此，flg22的离散多态性变化可以解除拟南芥FLS2的反应。我们的结果显示，这种解耦涉及监管机制，但尚未确定。与这一假设一致，一个共生的flg22表位子集断开了FLS2的信号输出。
图6.作为抑制免疫途径的受体复合物形成的竞争性拮抗作用（a）flg22结合FLS2和BAK1的GCI衍生结合动力学。所示为传感器图，数据以橙色和紫色标示，相应的拟合以黑色覆盖。耦合（ka）和离解（kd）速率常数以及离解常数kd如图所示(B）未处理或处理10天的拟南芥转基因幼苗（proFLS2:FLS2-GFP）中FLS2-BAK1共免疫沉淀（coIP/IP）的Westernblot分析用不同的flg22肽(C）FLS2-BAK1杂合物形成测定体外酶联免疫吸附试验。表示的是:在Paflg22（10nM）单独或增加flg20、flg22Q20D或flg22I21D的浓度时，2h的相对吸光度（abs650nm）。表示统计显著性（单因素方差分析，然后进行Dunnett多重比较检验；P<0.05)。(D）拟南芥转基因幼苗（proFLS2:FLS2-GFP）中FLS2-BAK1共免疫沉淀（co-IP/IP）的Westernblot分析未处理，用Pa-flg22肽处理（10nM）单独或与顶部所示浓度的不同flg22肽共同处理。flg22肽的特性标示在左边。这个实验重复了两次，结果相似。
接下来，我们测试niSEI肽是否能否定Pa-flg22诱导的免疫标记基因细胞色素P45071A12（CYP71A12）的激活。使用转录报告系统，我们确定，除flg22G18F外，所有niSEI肽均拮抗Paflg22诱导的CYP71A12（图S6C）。相反，与FLS2相互作用较少的表位不能阻止Paflg22诱导CYP71A12（图S6C）。然后我们测试了体外条件下，flg22Q20D和flg22I21D是否能拮抗Pa-flg22诱导的FLS2-BAK1杂合物的形成（图6C）。我们确定这两种肽在比Paflg22高50倍的浓度下很容易抑制这种相互作用。相反，Paflg20需要200倍的摩尔过量，才能达到相同的拮抗水平。最后，我们证明了体外实验中，是flg22Q20D和flg22I21D，而不是flg22D14K或flg22D15K，能拮抗flg22诱导的FLS2-BAK1相互作用（图6D）。因此，我们合成了拮抗flg22表位，抑制下游FLS2反应的激活，对运动性没有明显影响。
为了确定阳性上位性（positiveepistasis）对鞭毛蛋白功能的影响，我们评估了flg22GDG多态性对Pa和Ps运动性的影响（图7F、S7C和S7D）。而具有flg22GDG表位的fliC突变体不能拯救Pa和PsΔfliC，嵌合体恢复了12.5%的Ps运动性，但在Pa中没有（图7F和S7D）。这些结果强调了运动的可调性依赖于物种的概念（图5A和5B）。当单独引入时，每一个突变都恢复了18.5%的PaΔfliC运动性（图S7C）。因此，残基15、18和20可以负相互作用以控制Pa的运动。用flg22NSS衍生物进行的对照互补分析产生了几乎相似的结果（图7F和S7D），并进一步表明假单胞菌的运动性对flg22中的残基共变异非常敏感。第20位（flg22Q20G）的自然多态性，如niSEI肽flg22Q20D（图5B），提供了AP最均衡的分辨率（图7C和S7B）。总之，我们的结果表明，正上位性相互作用介导逃规避疫系统检测导致鞭毛蛋白功能的负面影响。我们认为flg22GDG样多态性最终可能在拟南芥上持续存在，因为通过拮抗剂活性降低免疫系统检测的益处大于对运动功能的负面影响。
讨论
有助于解释自然细菌群落如何维持核心微生物功能，同时规避免疫的进化机制的研究和报道很少，这主要是因为直接的分子证据很难通过实验获得。在这里，我们证明了AP改善了表位和免疫传感器之间的关系，反过来，我们也证明了细菌运动性和宿主识别之间的平衡在进化过程中是分子平衡的。
我们的结果表明flg22的>300的单一突变对Pa运动性有巨大影响。总的来说，我们的数据表明，flg2具有比预期更大的编码功能，该功能可大规模影响假单胞菌的运动，由此针对不太保守的残基的氨基酸变化也导致了严重的运动性缺陷。相反，一些保守氨基酸的突变对运动性没有明显影响。因此，表位中残基的进化不太可能由仅因在维持细菌运动性的选择性机制驱动。我们对flg22-FLS2相互作用的系统分析使我们能够确定，在拟南芥中，FLS2没有进化到监测运动所需的所有表位位置的水平。我们推测天然拟南芥种质已经在其鞭毛蛋白传感器中进化出这种能力，以微调和优先考虑它们对不同细菌的防御反应。与此一致的是，天然flg22表位诱导多种免疫反应。
大于1000个表位的定向进化扩展了我们对FLS2/flg22相互作用的理解。尽管我们的数据大多与已有的晶体学数据一致，但我们发现，除了针对Asp14/15、Gln20和Ile21的突变外，所有其他突变都针对具有与物理相互作用的侧链的残基FLS2ECD，在晶体结构中对相互作用没有重大影响。最值得注意的是，这种强大的相互作用仅通过在表位的C端部分引入具有相反静电荷的残基来调节。值得注意的是，这些静电效应在聚体衍生物15表位上被放大，这些衍生物被开花植物中的FLS2直向同源物普遍认为具有免疫原性。总的来说，我们建议在拟南芥中FLS2与突变鞭毛蛋白表位的强大相互作用建立了拮抗多效应，并有助于维持细菌种群中鞭毛蛋白表位的变异。
总之，我们的研究提供了更好地了解其他MAMP受体对在植物在低等和高等后生动物中分子进化的一个理论基础。例如，我们的研究可以作为一个模板来剖析由延伸因子Tu（EF-Tu）介导的细菌蛋白质合成是如何在芸薹科特异性EF-Tu受体（EFR）的识别下进化的。了解拮抗多效性如何影响EF-Tu表位的序列变异以规避免疫检测，同时在翻译期最大限度地发挥核糖体功能具有重要意义。总体而言，这里探讨的概念有可能重构我们对非自身进化（non-self-evolution）的理解。
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