今天带来的是2023年病毒清除研讨会的第五部分：病毒清除策略和工艺理解。
01
病毒安全：从过去吸取教训（From:BI）
[这章的重点内容]
在不同过滤压力的情况下，入口压力低于0.3bar时，检测到细小病毒去除率降低(箱型图的异常数据)，但是在其他实验中，低于0.3bar且能有效去除细小病毒。因此，决定将该除病毒过滤器(Planova20N)的工艺范围下限设置为≥0.3bar。（这是病毒清除平台化工艺的概念，非常重要！）
图1Planova20N过滤器对MVM清除率异常值的分析
图2SartobindQ对X-MuLV清除率的异常值分析
02
病毒清除率测定中的挑战：低病毒浓度的TCID50估计（FromNovoNordisk）
对于引起细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)的病毒，可使用Spearman-Krber方程计算病毒滴度，即TCID50。在此方法中，重复孔中接种浓度逐渐降低的测试材料，从而导致所有孔都感染转变为没有孔感染。根据不同浓度的测试材料感染孔的比例，计算TCID50。然而，Spearman-Krber方法仅在病毒在多个稀释度中或在最低稀释度下≥10%的孔中检测到时才准确。
Spearman-Krber方程：
在进行病毒清除研究时，偶尔会观察到病毒浓度较低，例如通过大体积滴定。对于低病毒浓度，最大似然(maximumlikelihood,ML)方法被广泛用于估计病毒滴度。在这些情况下，SK方法(Spearman-Krber)将用于工艺输入样品（高病毒滴度），ML方法用于工艺输出样品（低病毒滴度）。为了计算对数减少值，提出了一种将ML输出转换为TCID50的方法。
将ML输出转换为TCID50的公式：
将此表达式简化为仅在一次稀释中检测病毒，并将ML输出转换为TCID50得到：
当Spearman-Krber公式无法应用时，此公式提供了一种非常易于使用的方法来估计低范围内的TCID50。这可以在工艺步骤后仅观察到非常低的病毒浓度的情况下，确定对数减少值(logarithmicreductionvalue,LRV)。
03
利用基于病毒替代物的方法工具箱增强下游单元操作中病毒清除的可开发性
(FromRentschlerBiopharmaSE&KarlsruheInstituteofTechnology)
由于病毒加标研究成本高、耗时长，目前无法对下游操作中的病毒清除进行深度优化或表征。根据最近的报道，使用逆转录病毒样颗粒(retrovirus-likeparticles,RVLP)或鼠细小病毒样颗粒(minutevirusofmicevirus-likeparticles,MVM-VLP)的方法有可能克服这些层析、灭活和除病毒过滤步骤的瓶颈。替代方法在工艺开发和表征过程中特别有益，如以下针对不同类型的AEX和MM-AEX填料的三个案例研究所示。
在第一个案例研究中，我们评估了AEX层析步骤在结合/洗脱(B/E)模式下去除病毒的能力，该步骤在早期开发阶段就具有去除病毒的能力。高盐洗脱条件被认为是去除病毒的关键。在三个基于MVM-VLP的加标实验中，pH值逐渐增加0.5个单位。在任何实验中均未检测到MVM-VLP，结果的LRV≥3log10。根据这些结果，该工艺步骤被认为可以有效去除病毒。使用传染性MVM的验证运行证实了这一点（图3）。
图3通过AEX在结合/洗脱模式下清除MVM-VLP、MVM和MuLV
在第二个案例研究中，评估了单个缓冲液基质成分的变化对AEX膜吸附器的病毒去除能力的临界性。pH值和盐浓度保持不变，因此影响可以忽略不计。然而，去除效果非常微弱（LRV放弃了改变缓冲液体系，以保持病毒清除率（图4）
图4缓冲液改变对AEX膜吸附器在流穿模式下去除MVMVLP、MVM和MuLV的影响
在第三个案例研究中，使用DOE方法(这里使用了完全析因设计)表征了流穿模式下(FT)的MM-AEX层析步骤。MVM-VLP加标很容易集成到已计划好的实验装置中。主要挑战是处理基质的弱酸性pH值。可以在整个设计空间内确认稳健有效的病毒清除（见图5），同时杂质去除和回收率优化不会因MVM-VLP加标而受到影响.
图5DOE设置MVM-VLP加标研究，用于表征在流穿模式下运行的MM-AEX层析步骤（左图）。不同条件下的LRV结果（右图）
总之，基于病毒替代物的方法有可能使病毒清除成为可开发的质量属性，预测工艺变化的影响并实现病毒清除的表征。尽管价值很高，但VLP测试系统相当新，其与传染性模型病毒的可比性需要进一步评估。
04
病毒分离的重要性：残留的敏感性分析（NovoNordisk）[重点内容]
病毒清除的概念是通过单元操作（例如层析步骤）对病毒减少进行详细描述和定量测定。多个步骤的累积减少确保了最终产品的病毒安全性。
使用一个简单的方程来估算生产过程中的临界潜在残留(criticalpotentialcarryover,CPCO)，可以轻松计算出少量样品绕过单元操作步骤的后果（潜在的病毒从该步骤之前带到之后）：
CPCO表示预处理样品的体积，如果绕过该步骤并重新进入后步骤，将使病毒减少值降低2倍（或对数值为0.3）。
例如，假设1000L未处理的批次收获物(unprocessedbulkharvest,UPBH)含有E7RVLP/mL。那么该过程中的RVLP总量将为(E7RVLP/mLX1000mL/LX1000L)=E13RVLP。如果该捕获步骤的LRV为3.0log10，则捕获后的RVLP量将减少到E10RVLP。
CPCO为1000LXE(-3)=1L。这意味着，如果1LUPBH绕过该步骤，它将增加另外E10RVLP，带来总量为2XE10RVLP。在这种情况下，有效LRV将为log(E13/(2XE10))=2.7log10（图6）。
图6一根柱子的小体积残留物可能造成病毒交叉污染
在同一房间内进行多个步骤甚至所有步骤可大大提高累积LRV对残留物的敏感性。对于典型的单抗工艺，累积减少量为15log10，如果将低至0.005纳升的UPBH转移到最终纯化的原液中，则可能会影响整体清除率（图7）。
图7多层析柱对小体积残留病毒交叉污染的灵敏度增强
05
有效灭活制造表面杆状病毒的清洁剂(FromEliLilly)
表1使用清洁剂灭活杆状病毒
06
新范式：CygnusAlphaRVLP试剂盒与内部方法的评估(FromMerck)
据观察，RVLP存在于使用CHO作为宿主细胞生产的产品中。这些RVLP显然是有缺陷的且不具传染性；然而，由于其形态和生化特性与致瘤性逆转录病毒相似，RVLP理论上存在安全隐患。因此，RVLP病毒清除验证是全球产品市场注册的监管要求（符合ICHQ5A）。RVLP的标准测试是通过电子显微镜(EM)检测，其灵敏度低且数据变异性大。
本研究介绍了使用alphaMockVRVLP试剂盒与内部直接RT-qPCR方法（无RVLP提取）进行比较，使用来自两个MSD程序的中间体进行加标研究。讨论了方法的比较，包括定量和检出限以及分析操作的便利性。
图8通过传统系统与MockVRVLP系统评估的典型生物工艺流程的比较案例研究
07
案例1：第13-15天的RVLP定量是最差情况（产品A）
在这种情况下，RVLP会积聚在反应器上清液中，而产品则从渗透液中收获。因此，在生产周期后期测量截留液RVLP将比实际高出2log10以上，以计算RVLP安全系数。虽然监管机构可以接受最坏情况的估计，但最好有一个更现实的起始量估计。
案例2：渗透液中的RVLP不受灌流过滤器交换的影响（产品B）
在案例2中，渗透物过滤器本身能够捕获RVLP。同样，滞留物中的RVLP超过渗透物中的RVLP。过滤器的更换不会影响捕获；这是预料之中的，因为RVLP是基于大小的机制去除的。这一观察表明，分割现象(partitioningphenomenon)是稳健且一致的，这表明渗透物采样可能是RVLP测量更现实的采样点。
情况3：生产结束时的RVLP是最坏情况（产品C）
在案例3中，不同的宿主细胞系产生的颗粒似乎可以不受抑制地通过渗透过滤器。因此，需要单独分析每种产品/工艺，才能真正了解最终的RVLP安全系数
08
ASTM标准计划更新和前进之路(FromVirBiotherapeutics)
迄今为止，ASTM内部已经制定了三项标准：低pH灭活(ASTME2888-12StandardPracticeforProcessforInactivationofRodentRetrovirusbypH)、表面活性剂灭活(ASTME3042-16StandardPracticeforProcessSteptoInactivateRodentRetroviruswithTritonX-100Treatment)，以及2022年批准的最新标准—使用细小病毒截留过滤器进行逆转录病毒过滤(ASTME3259-22StandardPracticeforProcesstoRemoveRetrovirusesbySmallVirusRetentiveFilters)。
编写“细小病毒截留过滤器去除逆转录病毒的工艺标准”涉及九年内三家公司的四次投票。工作组召开了多次会议，回应了反对者的意见。最终投票采纳了多方的广泛反馈。
这一过程的第一步是查看两家VC测试机构的历史过滤数据，以支持该标准。在此基础上，做出了基础性决定，例如，排除了MVM数据，因为减压被认为对不同的过滤器来说太复杂了。关于标准中要指定的LRV水平，进行了重要但数据驱动的讨论，但最终决定是6.0log10。根据ASTM规则，标准不能命名特定的过滤器。
该方法包含的关键要素包括：
1压差保持在特定细小病毒截留过滤器制造商提供的规定限度内。2通过由除病毒过滤器制造商（使用的每个特定过滤器批次的分析证书）或生物制药制造商（使用前完整性测试结果）或两者执行的适当的使用前保证过滤器完整性测试3通过适当的使用后完整性测试。4过滤过程中还必须遵守细小病毒截留过滤器制造商提供的任何附加操作规范。细小病毒截留过滤器和本标准规范的最终用户必须证明这些参数在过滤操作过程中处于规定的限度内
此外，还讨论了ASTM病毒安全倡议总体计划的未来发展方向，包括将不同的治疗方式纳入现行标准以及维护和/或修订现行标准的可能性。示例包括：
最后，讨论了扩展到细胞/基因治疗领域的价值以及制定其他单元操作标准的可能性。