本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种活病毒快速检测方法及其应用。
背景技术：
pcr检测病毒核酸的方法虽然是一种快速检测的方法，然而单纯的病毒核酸pcr检测方法不能区分失活的死病毒和感染性活病毒。病毒外膜蛋白具有识别靶细胞并与之结合，进入细胞内，从而引起细胞感染的作用。被灭活的死病毒则由于病毒的外膜蛋白结构被破坏，病毒包膜脂蛋白层被溶解以及病毒复制所需酶类的活性被抑制等均可使病毒感染性丧失，即：死病毒是不会感染细胞的。伪狂犬病毒(prv)是一种常用的动物源医疗产品病毒灭活验证的指示病毒，目前尚没有能够特异性检测prv活病毒(不受死病毒干扰)的病毒核酸pcr快速检测方法。
技术实现要素：
基于此，本发明提供一种活病毒快速检测方法，采用该方法能够特异性地检出活病毒，可应用于病毒灭活验证实验中。
一种活病毒快速检测方法，包括以下步骤：
转染：将包括有死病毒和/或活病毒的待测病毒接种于预先在细胞培养板培养得到的单层宿主细胞，转染培养；
上述待测病毒中可能为死病毒，也可能为活病毒，或者二者兼而有之。最终检测到的活病毒含量以核酸拷贝数体现。
上述检测方法，利用死病毒不会感染细胞的原理，通过活病毒一旦侵染进入宿主细胞，从而收取含活病毒的细胞实现对死病毒和活病毒的分离。并针对prv病毒建立了细胞培养和病毒核酸检测相结合(integratedcellculturequantitativepcr，icc-qpcr)的分子生物学方法。从而通过考察最初的活病毒吸附进入宿主细胞的量来区分死病毒和活病毒，随后通过提取细胞及细胞内活病毒dna进行病毒核酸定量检测，建立了能够区分活病毒和死病毒的icc-qpcr快速检测方法。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，所述检测步骤中，进行病毒dna检测所用引物对如下：
fp：5'-gtcaccttgtggttgttg-3'，
rp：5'-ccacatctactacaagaacg-3'。
以上述引物对进行检测，经验证具有较好的特异性。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，以下述反应条件进行扩增检测：
预变性：95℃30s；
扩增：95℃10s，60℃20s，72℃10s，循环数40；
溶解：95℃10s，60℃60s，95℃10s。
以上述反应条件进行扩增检测，经验证具有较好的线性范围。
在其中一个实施例中，所述检测步骤中，以prv质粒dna作为定量标准品对病毒dna进行定量检测；
所述prv质粒dna通过以下方法制备得到：扩增prv的特异性基因序列，将该扩增片段的电泳产物回收纯化后连接到克隆载体进行克隆，阳性克隆通过qpcr进行鉴定，培养阳性克隆并提取质粒dna，经核酸电泳及测序确认后即可作为prv质粒dna标准品。
用pvr病毒特异性引物和prv病毒特异性质粒dna标准品(用于定量标准曲线)，进行定量pcr检测，具有较好的定量测定效果。
在其中一个实施例中，所述prv的特异性基因序列以如下引物对进行扩增：
rp：5'-ccacatctactacaagaacg-3'，
上述扩增片段长度为170-190bp(目标片段为180bp)；所述克隆载体为pmdtm18-t克隆载体。
本发明公开了上述的活病毒快速检测方法在病毒灭活工艺有效性验证中的应用。
上述活病毒快速检测方法，可通过考察最初的活病毒吸附进入细胞这一过程来区分死病毒和活病毒，随后通过提取细胞及细胞内活病毒dna进行病毒核酸定量检测，建立icc-qpcr方法应用于病毒灭活验证中。
本发明还公开了一种病毒灭活工艺有效性验证方法，包括以下步骤：
病毒负载：将含有活病毒的指示病毒液负载到预定样品中；
病毒灭活：按照待验证的病毒灭活工艺处理上述经病毒负载的预定样品；
样品收集：将上述经病毒灭活工艺处理的负载指示病毒液的预定样品进行病毒灭活工艺终止处理，得到处理后样品；
残留活病毒检测：将处理后样品按照上述的活病毒快速检测方法进行检测，得到处理后样品中残余活病毒含量；
有效性分析：根据上述检测得到的活病毒残余含量，评价待验证的病毒灭活工艺的有效性。
可以理解的，上述验证方法可用于验证以指示病毒(如prv)进行的任何医疗(如电生理导管)或非医疗样品的任何病毒灭活工艺(如环氧乙烷病毒灭活工艺)的病毒灭活效果。
在其中一个实施例中，所述残留活病毒检测步骤中，先将上述处理后样品进行匀浆、0.22微米除菌滤膜过滤，再以过滤液作为待测病毒样品。
在其中一个实施例中，所述污染物负载步骤中，所述指示病毒液通过以下方法制备得到：将pk15细胞接种于细胞培养瓶，用细胞生长培养液培养至细胞长至单层，接种prv病毒，病毒吸附后吸除液体，加入维持培养液继续培养至细胞病毒病变明显时，将染毒细胞反复冻融，离心取上清，收获prv病毒，即得。
所述模拟污染物为全血模拟污染物，该全血模拟污染物按照枸橼酸化绵羊全血：小牛血清：生理盐水：2mcacl2为90-110ml：45-55ml：45-55ml：0.005-0.015ml的配比制备得到。
prv病毒是常用的有包膜dna型指示病毒，以pk15作为宿主细胞进行染毒，病毒侵染性好，通过检测细胞内的活病毒，能够客观地验证病毒灭活的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
该方法可以有效地检测病毒灭活工艺后的残留活病毒。其定量限为104copies·μl-1(约相当于2logs)，检测限为103copies·μl-1(约相当于-1log)。可以检出prv感染滴度的最低检测限为-1log，比传统cpe法(-0.5lg)灵敏度高。
附图说明
图1为实施例1中建立的icc-qpcr标准曲线；
图2为实施例1中prv感染pk15细胞引起的细胞病变效应(放大倍数×100倍)；
图4为实施例1中cpe法检测病毒滴度与icc-qpcr法检测dna拷贝数之间的线性关系示意图。
具体实施方式
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
以下实施例所用的材料与仪器如下：
1病毒与细胞
伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv，bartha株，购自中国兽医药品监察所)；pk15细胞(市售购得)。
2材料
一次性电生理导管由北京大学第一附属医院收集、灭菌后提供。
3主要试剂
胎牛血清、细胞培养液(均购自gibco公司)；无菌抗凝绵羊全血、青链霉素混合液、eb染料、琼脂(lb)固体培养基干粉、lb液体培养基干粉、氨苄青霉素储存液、50×tae缓冲液、markeridnaladder、6×dna上样缓冲液、琼脂糖、dh5a感受态细胞(均购自北京索莱宝科技有限公司)；氯化钠注射液(石家庄四药有限公司)；无水氯化钙(国药)；磷酸盐缓冲液(pbs，hyclone)；环氧乙烷(eo)灭菌剂(河南三强医疗器械有限公司)；blood&tissuekit(qiagen)；exdnapolymerase、胶回收试剂盒、pmdtm18-tvectorcloningkit、质粒提取试剂盒、premixextaqtmⅱ(takara)。
pcr引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
4仪器
二氧化碳培养箱(bb150，thermo)、离心机(3k15，sigma)、倒置显微镜(axiovert.a1，zen)、酶标仪(spectramaxm5，moleculardevices)、实时荧光定量pcr仪(lightcycler480ⅱ，roche)、基因扩增仪(pc-707-02，astec)、电泳仪(powerpacbasic,bio-rad)、环氧已烷灭菌柜(sq-h40，河南三强医疗器械有限公司)、数显型医用封口机(sq-f，河南三强医疗器械有限公司)。
实施例1
一种活病毒快速检测方法(即icc-qpcr方法)的建立及验证。
一、qpcr方法的建立及验证。
1、质粒dna标准品的制备。
prv(伪狂犬病毒)的株系类别为barthar株，gb是该株prv的一个基因名称。参考genebank中barthar株gb基因序列，经过实验筛选和验证，选定下述引物组作为本实验研究用引物，其引物序列为：
fp：5'-gtcaccttgtggttgttg-3'(seqidno.1)
rp：5'-ccacatctactacaagaacg-3'(seqidno.2)
以上述引物组扩增片段长180bp。将该扩增片段的电泳产物回收纯化后连接到pmdtm18-t克隆载体进行克隆，阳性克隆通过核酸电泳及qpcr进行初步鉴定，培养经鉴定的阳性克隆并提取质粒，用酶标仪测定质粒浓度及纯度。最终获得的质粒dna标准品通过测序进一步鉴定。
2、扩增体系。
用takara公司tbpremixextaqⅱkit的试剂进行荧光定量pcr检测，反应体系为：premix10μl，上、下游引物各0.2μl(20pmol·μl-1)，无dna/rna酶的水7.6μl，模板dna2μl。反应条件为：95℃预变性30s；扩增：95℃10s，60℃20s，72℃10s，循环数40；溶解：95℃10s，60℃60s，95℃10s。
3、标准曲线的线性范围、检测限、定量限。
3.1方法。
按下述公式计算上述获得的质粒dna标准品的拷贝数：
copies＝(质量/分子量)×6.02×1023
将其10倍系列稀释，取1.0×108～1.0×100copies·μl-1的质粒dna标准品，每个浓度3个复孔，考察方法的检测限。
用1.0×103～1.0×108copies·μl-1的质粒dna标准品进行测定，并以dna拷贝数的对数值与所得的ct值绘制标准曲线，确定最佳线性范围和定量限。
3.2结果。
用含有目的片段的prv质粒dna标准品1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103copies·μl-1作为模板进行荧光定量pcr反应。
4、特异性验证。
4.1方法。
将1.0×106copies·μl-1的prv质粒dna、pk15细胞dna和atcc9372菌dna(作为阴性对照)作为模板进行pcr测定，验证荧光定量检测方法的特异性，每种样品进行3个重复。
4.2结果。
特异性验证结果表明除prv质粒dna有扩增外，其他dna模板均无扩增，说明本实验方法具有较好的特异性。
5、重复性验证。
5.1方法。
选用1×108、1×107、1×106、1×105copies·μl-1的质粒标准品，进行一次实验多个重复和不同次试验的重复性考察，评价方法的重复性。
5.2结果。
一次实验的3个重复和3次重复实验的结果见下表，其rsd＜5％，说明方法的重复性好。
表1.重复性实验结果
二、icc-qpcr方法的建立及验证。
1、prv病毒液的制备。
将pk15细胞以1.0×106个接种于75cm2细胞培养瓶，用含10％胎牛血清(fbs)的细胞生长培养液(含10％fbs的mem)培养至细胞长至单层，接种prv病毒，置于37℃吸附2h后吸除液体，加入含2％fbs的mem维持培养液继续培养3d。将染毒细胞反复冻融3次，离心取上清，收获prv病毒。
prv病毒接种48h后能明显看到大多数细胞圆缩、散落，如图2所示，图中，a为正常pk15细胞，b为prv感染pk15细胞。细胞病变最为明显的时期为48h～96h，此时维持液中病毒含量高并且稳定。收取培养72h的病毒液，置-70℃备用。
2、prv病毒滴度的测定。
将pk15细胞以每孔5×103个接种于96孔细胞培养板，培养24h，吸除液体，pbs漂洗1次。将制备的prv经10倍系列稀释后以每孔100μl接种于pk15细胞，37℃吸附2h，吸除液体，pbs漂洗1次，加入含2％fbs的维持培养液，每孔200μl，于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养3d，采用reed-muench方法计算每毫升的log数(tcid50法)。
以无血清培养液代替prv接种作为正常细胞对照；以高温高压灭活的prv病毒接种作为阴性对照。
将病毒滴度与相应的病毒dna检测值(每微升拷贝数)的对数做线性回归分析，结果显示icc-qpcr检测dna的每微升拷贝数对数与病毒滴度(每毫升的log数)在每毫升4～8logs区间具有良好的线性关系，线性方程为：y＝0.349x+6.224，r2＝0.998(如图4所示)。因此，可以据此将icc-qpcr法检测的病毒dna拷贝数推算成病毒滴度。
并且，icc-qpcr方法测定病毒dna结果显示，虽然病毒滴度低于4logs时不能直接定量，但是，当prv病毒滴度≥每毫升-1log时，prv核酸均可检出，当prv病毒滴度＜每毫升-1log时，未检出prv核酸，即：icc-qpcr方法的最低检测限为每毫升-1log，明显低于cpe法(每毫升-0.5log)。
上述结果说明，本发明的活病毒快速检测方法(即icc-qpcr)，通过制备指示病毒(伪狂犬病毒，prv)质粒dna作为定量标准品，用prv特异性引物建立定量pcr方法；再将病毒染毒宿主细胞(pk15细胞)，通过检测细胞中活病毒，建立prv的icc-qpcr活病毒快速检测方法，可以有效检测prv活病毒，比传统cpe法(-0.5lg)灵敏度高。
实施例2
prv的icc-qpcr检测方法在一种病毒灭活工艺(电生理导管环氧乙烷病毒灭活工艺)有效性验证的应用。
1、污染物负载。
基于电生理导管的物理特征、临床应用、污染物的特性，选择全血试验污染物(枸橼酸化绵羊全血100ml、小牛血清50ml、生理盐水50ml，使用前加入2mol/lcacl20.01ml)，模拟临床使用后的污染情况。将高滴度的prv病毒加入到全血试验污染物中制备含有prv病毒全血试验污染物。
使用12根无菌实心电生理导管，通过测量实验污染用导管轴的长度(l)和直径(2r)(游标卡尺测定)，计算实验污染导管的近似表面积(s＝2πrl)约为12.05cm2。将电生理导管前端10cm部分浸泡入模拟污染物1h，然后取出自然晾干4h。实验设定4组，每组平行3根导管，具体分组如下：
1)空白对照组：3根导管不经任何处理，提取空白导管清洗液作为空白对照；
2)阴性对照组：用不含病毒的全血试验污染物负载3根导管，用于提取污染物作为阴性对照；
3)零时组：用含病毒全血试验污染物负载3根导管，用于病毒灭活前的零时对照；
4)病毒灭活组：用含病毒全血试验污染物负载3根导管后，用既定的环氧乙烷灭菌工艺灭菌，检测活病毒降低量或滴度。
2、环氧乙烷灭菌。
在模拟污染物负载并晾干后，将负载污染物的电生理导管单个置于环氧乙烷包装袋内，放入灭菌生物指示卡并密封。
3、样品提取。
用无血清培养液1ml清洗提取灭菌后的各组导管前端10cm的样品，重复3次，提取液合计为3ml。
4、icc-qpcr法验证病毒灭活有效性。
5、检测残留活病毒。
5.1按照上述建立的icc-qpcr方法进行检测。
含病毒全血污染物负载到导管中零时组的prv拷贝数约106copies·μl-1(约相当于8～9logs)；环氧乙烷工艺灭菌后各导管可检出prv病毒，但prv拷贝数均低于本方法的定量限(104copies·μl-1，约相当于2logs)；阴性对照组和空白对照组均未检出prv。本方法的检测限为103copies·μl-1(约相当于-1log)，因此，推算出病毒滴度下降≥9logs。具体结果见下表2。
表2icc-qpcr结果
5.2cpe法验证病毒灭活有效性。
为验证本发明所建立的prv的icc-qpcr检测方法用于病毒灭活验证的适用性，在此，用传统cpe法进行佐证。
1)方法：将提取的各组样品1ml进行10倍梯度稀释，至少稀释10个浓度，按照传统病毒滴定法进行滴定。培养3d左右后在倒置显微镜下观察并记录细胞病变情况。按reed-muench方法计算各组样品每毫升的lg数。
2)结果：利用cpe法观察细胞病变，计算环氧乙烷病毒灭活工艺后病毒滴度降低量。零时组和病毒灭活组在培养2d后，细胞出现明显病变。而阴性对照组及空白导管组在滴定培养3～5d的过程中均未出现细胞病变。
本实验中cpe法的检测限为每毫升-0.5lg。电生理导管中负载的生物模拟污染物中prv经环氧乙烷工艺后，病毒滴度下降了≥8.5lgs(见表3)。
表3复用电生理导管中指示病毒(prv)灭活验证结果
cpe法病毒灭活验证结果表明经环氧乙烷灭活后的病毒负载导管其病毒滴度降低＞8.5lgs，而icc-qpcr结果表明其病毒滴度降低＞9lgs。两种方法均说明电生理导管的环氧乙烷工艺是有效的病毒灭活工艺。两种方法相互印证，充分证明了工艺有效性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。