选择骨科脊柱手术ASAⅠ～Ⅱ级择期手术患者60例，男35例、女25例，术前排除内分泌系统疾病，无使用皮质类固醇药物。随机分为两组实验组（输注MB/光化学法灭活血浆组）30例和对照组（输注普通新鲜冰冻血浆组）30例。
1.2仪器与试剂
病毒灭活箱；亚甲基蓝（MB）；西安262厂生产的FJ-2008型γ-免疫计数仪；美国产EPICS-ELITE流式细胞仪；总医院东亚放免所提供的药盒（卫药准字R-68号）。
1.3血浆制备
MB/光化学病毒灭活法是将MB加入液体血浆中混匀，置于血浆病毒灭活箱中，温度4℃，光照射强度30000～35000lux，照射35min，然后过滤去除亚甲基蓝，同时也滤除血浆中存在的白细胞和已灭活的病毒。
1.4实验方法
1.5统计学处理
用SPSS10.0统计学软件处理，数据以均数±标准差（χ±s）表示。采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
3讨论
近些年来，国内外曾应用巴斯德液态湿热灭活法、有机溶剂/洗涤剂法、膜过滤法等方法对血浆病毒进行灭活，但处理难度大，费用高，不能广泛应用于临床中单袋血浆的病毒灭活。
MB/光化学灭活病毒是近年来发展起来的新技术，是一种在光激发下的物理化学方法，在有氧条件下，光敏剂亚甲基蓝分子在波长为600～700nm、强度30000～35000lux的光照作用下可激发产生多种氧物质（氧自由基、羟自由基等），这种氧物质可引起病毒核酸链的断裂，阻止其复制[1]，破坏病毒结构，进而影响病毒功能，最终导致病毒死亡，因此随着新型光敏剂和发光设备的出现，光化学疗法以其对组织细胞损伤小、毒副作用少等优点，广泛应用于临床[2]。尤其对HBV、HCV、HIV等病毒灭活效果更为理想[3]。
心钠素是由心房肌细胞分泌的具有扩张血管、降低血压的内分泌多肽；内皮素是一种具有强烈收缩血管作用的多肽类内源性损害因子，两种物质在循环系统中心血管功能调节方面起着关键性作用，在正常健康人机体中二者互相拮抗而动态平衡[4]。
本实验中两组患者ET、ANP值输血浆后与麻醉前比较显著升高（P＜0.01），说明在输血浆后均可引起某些血管活性物质的释放；实验组ET在T1、T2点与对照组相比分泌减少（P＜0.01），说明有利于循环系统的稳定；实验组ANP在T1、T2点与对照组相比释放增加（P＜0.01），说明实验组可增加ANP的释放，平衡内环境的稳态。
通过实验证明，临床应用经MB/光化学法灭活的血浆在灭活病毒等方面优于普通血浆，同时还可促进血管活性物质释放，临床应用相对安全，但对血浆其他成份是否有影响还有待进一步研究。
[参考文献]
[1]EpeB，MutzelP，AdamW.DNAdamagebyoxygenradicalsandexcitedstatespecies：acomparativestudyusingenzymaticprobesinvitro[J].ChemBiolInteract，1988，67（1-2）：149-165.
[2]周裕凯，张兰.亚甲基蓝光化学疗法处理血液中肿瘤细胞的展望[J].中国煤炭工业医学杂志，2010，13：823-825.
[3]张耀，熊鸿燕，马菲，等.亚甲基蓝光化学法对全血中人免疫缺陷Ⅰ型病毒的灭活研究[J].第三军医大学学报，2004，26：1962-1963.
[4]李凤玲.内皮素、心钠素与糖尿病肾病[J].右江民族医学院学报，2000，22，465-466.
【关键词】
亚甲蓝；病毒灭活；冷沉淀；可行性
Feasibilitystudyoncryoprecipitatemadefromfreshfrozenplasmainactivatedvirusbymethyleneblue
SUNShu-li,LIJie,YUJian-hua.WeihaiBloodCenter;WeihaiWomenandchildrenhospital
【Abstract】Objective
Studyonfeasibilityofcryoprecipitatemadefromfreshfrozenplasmainactivatedvirusbymethyleneblue.MethodsTestedFⅧandFbginCryoprecipitate,contrastedcryoprecipitatemadefromfreshfrozenplasmawithcryoprecipitatemadefromhomologousfreshfrozenplasmainactivatedvirusbymethyleneblue.ResultsFⅧandFbgweredecreasingobviouslyincryoprecipitatemadefromfreshfrozenplasmainactivatedvirusbymethylenebluecomparedwithFⅧandFbgincryoprecipitatemadefromhomologousfreshfrozenplasma.
【Keywords】
methyleneblue；inactivatedvirus；cryoprecipitate；feasibility
冷沉淀因富含凝血因子Ⅷ(FⅧ)、纤维蛋白原(Fbg)等，而被广泛用于治疗儿童甲型血友病、血管性血友病、纤维蛋白原缺乏症等，且疗效明显。冷沉淀中FⅧ和Fbg的含量是直接影响其治疗效果的重要因素［1］。目前，因我国血液检测传染性标志物的主要方法是酶联免疫检测，血清转换窗口期、病毒变异以及低病毒载量的慢性携带等均可造成漏检，给输血带来一定的风险。采取有效措施，在保证冷沉淀输注安全的同时，又保证其有效性显得尤为重要。通过对亚甲蓝病毒灭活新鲜冰冻血浆制备冷沉淀质量的检测，评价分析亚甲蓝灭活后血浆制备冷沉淀的可行性。现总结如下。
1材料与方法
1.1仪器与试剂日本sysmexCA530血凝仪；Dade德灵血凝试剂Fbg批号：540938、乏FⅧ批号：546547、APTT批号：547116、CaCl2批号：539446；威高WG-LRH-I型冷沉淀血浆制备仪；德国贺利氏大容量离心机。山东淄博中保康医疗器具有限公司生产的病毒灭活柜及配套病毒灭活血浆袋。
1.2方法
1.2.1冷沉淀原料血浆的制备联袋采集CPDA-1抗凝血液400ml/袋，并分离新鲜血浆(200ml/袋)。随机抽取新鲜血浆60袋，每袋准确均分为100ml2，分别作为A组、B组。A组立即置于-50℃速冻机中速冻，-30℃保存备用，即新鲜冰冻血浆组；B组用MB/光化学法进行病毒灭活后，再置于-50℃速冻机中速冻，-30℃保存备用，即病毒灭活新鲜冰冻血浆组。整个过程于采血后6h内完成。
1.2.2冷沉淀的制备将上述A、B组冰冻后血浆在相同的条件下，按常规方法制备A组和B组冷沉淀，及时置于速冻机中速冻保存备用。
1.2.3留样与检测将上述A、B组冷沉淀取出，置37℃水浴融化，称重，然后留样各2ml，用血凝仪快速测定其FⅧ和Fbg的含量。FⅧ采用一期法测定，Fbg采用凝固法。
1.3统计学处理
检测数据以均数±标准差(x±s)表示，两样本均数比较采用t检验,P
2结果
用亚甲蓝病毒灭活新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀，FⅧ和Fbg的含量均有明显降低。与新鲜冰冻血浆制备的冷沉淀比较，FⅧ保有率为(64.5±18.9)%，Fbg保有率为(49.7±18.5)%。FⅧ活性基本可以达到《全血及成分血质量要求》的标准，但Fbg含量明显低于标准要求［2］。(见表1)
3讨论
采用亚甲蓝病毒灭活新鲜冰冻血浆制备冷沉淀，虽然可以降低输注冷沉淀传染病毒的风险，但因FⅧ和Fbg含量损失过大，直接影响冷沉淀输注的有效性。因此，本人认为制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆不易进行亚甲蓝病毒灭活。尽快找到并推广适合冷沉淀的病毒灭活方法是亟待解决的问题。
参考文献
［1］黄虹,陆典瑞,胡继征.冷沉淀制备工艺改良.临床输血与检验,2007,9(2):144.
1牛痘的诞生使天花得以完全被消灭
天花曾使欧洲3亿人丧生。人类利用疫苗预防传染病的历史至少可以追溯到公元10世纪宋朝真宗年间，当时我国已有接种人痘预防天花的记载。17世纪末，英国乡村医生爱德华琴纳发明了接种牛痘预防天花的方法，标志着人类首次通过有意识地预防接种来控制天花的科学实验获得成功。1977年10月，人类在索马里消灭了最后1例天花病例。1980年，世界卫生大会正式宣布在全世界范围内消灭了天花。
2传统疫苗可有效控制一系列传染病
过去，疫苗被简单地定义为一种可诱导疾病免疫性的灭活或减毒活致病因子。换言之，传统疫苗包括减毒活疫苗和灭活疫苗。
2.1减毒活疫苗
狂犬病虽至今仍保持着人类传染病最高病死率的记录――近乎100％，但它始终没有成为一种导致众多人群死亡的疾病，其中疫苗起了决定性的作用。19世纪中叶，法国科学家巴斯德发明了细菌的纯种培养技术以及减毒疫苗的制备技术，并于1885年首次成功地在人体使用减毒狂犬病疫苗，表明人类可用实验室研制的疫苗来预防传染病，使预防接种进入了新纪元。巴斯德也因总结出免疫接种原理和奠定了疫苗制备的理论基础而被誉为“疫苗之父”。
法国科学家Camette和Guerin在1906年从牛体分离到1株结核菌，经过13年在牛胆汁中传递230代，获得1株减毒株，制成的疫苗于1927年上市，即卡介苗。实际上，减毒疫苗就是由通过筛选或采用人工定向变异的方法培养出的毒力显著减弱或基本无毒的活的微生物制成的疫苗。减毒活疫苗接种后，在机体内有一定的生长、繁殖能力，可使机体发生类似隐性感染或轻度感染的反应，但却不产生临床症状，免疫效果强而持久，且用量较小，除刺激机体产生细胞免疫和体液免疫外，尚能产生局部免疫保护作用。然而，减毒活疫苗须在低温条件下保存及运输，有效期相对较短，还存在毒力返祖的风险。麻疹疫苗也是典型的减毒疫苗，于1945年后研制成功，由此使得在儿童中死亡率很高的麻疹发病率和死亡人数迅速下降。
2.2灭活疫苗
灭活疫苗选用免疫原性强的病原微生物经培养、以物理或化学方法将其灭活后，再经纯化制成。19世纪末，疫苗学领域里已有了3种细菌灭活疫苗即伤寒、鼠疫和霍乱灭活疫苗，这使得急性传染病的肆虐范围进一步缩小。上世纪20年代，巴斯德研究所的Ramon应用化学灭活方法获得白喉和破伤风类毒素并研制成疫苗，这是人类首次用化学灭活方法获得疫苗，是疫苗史中的重要进步之一。
3更有效地控制传染病已成为疫苗发展方向
传统疫苗的使用为人类预防传染病传播作出了重要贡献。但是，疫菌在生产和使用中存在不安全性。而且有的预防效果也不很理想。
随着人类科学技术的发展，越来越多的新技术运用于疫苗领域。Enders等采用病毒体外细胞培养技术，促进了多种减毒和灭活病毒疫苗的研制。20世纪50年代的3价灭活和3价减毒脊髓灰质炎疫苗为在全球消灭脊髓灰质炎提供了有力武器。科学家们还在鸡胚细胞中培养出减毒的麻疹疫苗、流行性腮腺炎疫苗和风疹疫苗，其中在人二倍体细胞中培养出的WistarRA27／3株风疹疫苗已在世界范围内获得推荐使用。纯化技术也促进了多个侵袭性细菌荚膜多糖疫苗的研制成功，包括脑膜炎球菌、肺炎球菌和第一代B型流感嗜血杆菌等疫苗。同时，病毒蛋白纯化技术亦促进了血源性乙型肝炎病毒疫苗的研制成功。随着乙肝疫苗的普遍接种，我国儿童乙肝病毒携带率已从10％下降到1％。
3.1裂解灭活疫苗
裂解灭活疫苗是在灭活疫苗的基础上经裂解(用裂解剂将病毒的结构蛋白如基质蛋白等释放出来，并溶解部分表面糖蛋白)和纯化而得的纯化疫苗。这类疫苗既含有内部抗原、也含有外部抗原，可以全面刺激抗体产生，同时由于去除了类脂质等反应原，不良反应大为减少。流感裂解疫苗的免疫效果及安全性已在国内、外的广泛应用中得到了肯定。
流感由流感病毒引起，是一种具有高度传染性的急性发热性呼吸道疾病。流感病毒是有包膜的分节段RNA病毒，分为甲、乙和丙三型，但只有甲型和乙型病毒能在人类中引起严重疾病。甲型流感病毒根据病毒表面抗原血凝素(hemagdutinim，HA)和神经氨酸酶(neuramindase，NA)的不同可进一步分为不同的亚型，至今已发现了16种HA亚型和9种NA亚型。1918-1919年起源于美国的“西班牙流感”，其病毒类型是H1N1；1957-1958年的亚洲流感流行共导致200万人死亡，该流感的病毒类型为H2N2。当1936年WisonSmith和ThomasFranis分别在禽胚中研制成功两种灭活甲型流感疫苗时，或许他们也没有料到这只是拉开了人类通过研制疫苗同流感斗争的序幕。
眼前自2009年3月起暴发流行的甲型流感是由人流感、禽流感和猪流感病毒的基因片段经融合而成的新型甲型H1N1流感病毒株，人类对其缺乏免疫力，以致造成一波又一波的暴发。美国在2009年9-11月共批准了5个甲型H1N1流感疫苗，其中包括4个肌肉内注射接种的灭活疫苗和1个经鼻腔给药接种的减毒疫苗；欧盟也在2009年9-10月间批准了3个肌肉内注射接种的灭活疫苗，其中包括1个全病毒灭活疫苗和2个灭活裂解疫苗。我国目前普遍应用的是无佐剂灭活裂解疫苗，接种后的阳转率和保护率均超过85％。裂解疫苗的各组分无感染性，不会引起甲型H1N1流感。甲型H1N1流感疫苗的不良反应同既往的季节性流感疫苗相似，包括：
局部不良反应如疼痛，偶见红、肿、瘙痒；全身不良反应如发热、疲劳、乏力、头痛、头晕和恶心，偶见咽喉疼痛、肌肉疼痛、咳嗽、腹痛、关节疼痛、口干和过敏等。不良反应以轻度为主，主要发生在接种后24h内。同季节性流感疫苗一样，接种甲型H1N1流感疫苗也可能发生罕见的不良反应，如休克和格林-巴利(Guillain-Barre)综合征等神经系统疾病。
3.2亚单位疫苗
3.3基因工程疫苗
20世纪70年代以后，随着基因工程技术的发展，人们开始利用其来生产疫苗。所谓基因工程疫苗是指，将编码某种病原体抗原(某种蛋白)的基因插入到细菌或真核细胞内染色体的基因组中，利用细菌或细胞生产病原体的抗原(而不是病原体本身)作为疫苗，所以这种疫苗很安全，被称为第二代疫苗。例如，将编码乙肝表面抗原(HBsAg)的基因插入酵母菌基因组中制成的DNA重组乙型肝炎疫苗就属于第二代疫苗，现已全面替代原有的血源性疫苗。目前，我国也已应用基因工程技术成功地研制出脊髓灰质炎、甲型肝炎和乙型肝炎病毒基因工程疫苗。
3.4DNA疫苗
机体对抗原攻击所产生的特异性免疫反应是针对蛋白的，而蛋白是受基因编码的。如果不接种蛋白而直接把其编码信息“告诉”机体，会不会产生免疫反应呢DNA疫苗技术研究的正是这一类新型疫苗。实际上，DNA被携带在实验室构建的质粒中，质粒是细菌内独立于染色体外的DNA，能在细菌胞浆中独立复制，并具有基因的特性。质粒经各种途径注入体内后，其中含有的DNA能被宿主细胞阅读，并通过宿主细胞蛋白表达系统表达抗原蛋白，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。由于通过PCR反应可产生大量DNA，不同基因的DNA可同时接种，而抗原的持续表达还可免去疫苗加强接种，这些优点激励研究人员积极探索。DNA疫苗兼有基因工程疫苗的安全性和减毒活疫苗激发机体强免疫反应的性质，同时具有免疫效果持久以及制备简单和价廉等优点，故被称为是第三代疫苗。
3.5疫苗给药途径
疫苗的研发进展同样反映在疫苗给药途径方面。人们现已发现，对某些呼吸道、消化道和生殖道感染性疾病的免疫预防，经黏膜给药可能是更有效的给药途径。因此，研制经滴鼻、口服、阴道或直肠栓剂等给药途径的疫苗成为疫苗研发领域的又一热点，具体方法包括采用能感染黏膜内壁细胞的载体、能提高置于黏膜上的抗原免疫应答的佐剂和能黏附于黏膜上的细胞黏膜剂等。
3.6联合疫苗和治疗性疫苗
至20世纪末，科学家们已研制和推广应用了30多种安全、有效的疫苗，使人类消灭了天花、制伏了霍乱，有效控制了百日咳、白喉、破伤风、乙型脑炎和脊髓灰质炎等多种严重传染病。由于某些人群(如幼儿)需在某个特定时期先后接种多种疫苗，故为方便计划免疫，人们又开始研制了联合疫苗。目前，三联疫苗(如百白破疫苗)已得到广泛使用，六联疫苗也已经问世，七联和八联疫苗正在研制中。除预防性疫苗外，科学家们近年来还在研制治疗性疫苗，如乙肝病毒和幽门螺杆菌的治疗性疫苗等，以期通过免疫接种疫苗产生抗体等免疫应答来攻击已致病的病原体。
点。着重阐述采用纯物理方法“过滤+紫外”技术路线设计生产的中远“海盾”压载水处理系统及其产业化应用成果现状。
关键词：船舶压载水处理技术产业化应用
目前，船舶运输是全球物流链中重要的一环，国际贸易中的80%以上货物通过船舶转运。船舶空载时为了保持一定的吃水深度不至于倾覆，在起航时要将一定量的海水抽进舱底以增强抗风浪能力，到载货时再将水放出，这部分海水称为船舶压载水。远洋船舶在注入和排放压载水的同时，引起有害水生物和病原体的跨海域传播，压载水的无控制排放对海洋生态、公众健康造成严重危害，由此引起的海洋生态破坏事故不胜枚举，全球环保基金组织（GEF）将其列为海洋四大危害之一。如近年香港等地发生的压载水传播细菌造成红潮使鱼、贝类感染并导致人类食物中毒和渔业破坏；亚洲北部生长的藻类由于压载水排放已入侵南澳大利亚并迅速取代当地海床生物群落等等。
压载水处理技术分析
目前，国内外处理船舶压载水的方法有25种之多，但总体来说，依据处理原理的差异可以划分为物理处理和化学处理两种类型。
1、物理处理方法
物理处理方法通过不同手段分离、排除或灭杀海水中的危害性生物与物质，主要手段包括过滤、离心分离、加热、光辐射、稀释与置换等。
过滤是一种通过过滤装置滤除海水中的一定体积微生物或其他污染物的处理方法。过滤法可直接滤除部分外来生物，通过选择合适的网目，可以有效地去除不同的生物种群。目前开发使用的过滤方法包括超滤、纳滤等过滤膜件。该方法原理简单、安装方便、初装成本相对不高。过滤法被认为是一种对环境危害最小的压载水处理方法，但在大型船舶中很难用于处理大量的压载水，处理效果有限，无法单独处理压载水。
旋流分离法是利用水流在管路中高速流动产生的分离作用，将液体的水和固体的生物与病原体分离开。这种方法可以除去大多数多细胞动物和植物、卵、幼虫和有害的病原体细菌，但是比重和海水相近的生物和颗粒难以去除，处理效果受到限制。
光辐射方法应用较多的光频段是加热与烧灼能力强的紫外线，紫外线用于杀菌消毒在其他行业已经有了较多的应用实例。紫外线处理装置对杀灭海洋细菌、病毒与细小微生物非常有效，处理过程不会产生二次污染，装置操作管理简便，运行成本低。但该方法不能杀死所有有害生物，当海水污浊度较大时，其效果会受到影响，因此该方法与过滤法配合使用效果最佳。
稀释法是通过管路的设计，将清洁的海水从压载舱顶部注入同时从底部排出的方法，稀释法因设计船舶设备、管路的改进或添置，因此仅仅在新船上使用。
2、化学处理方法
化学法主要是通过改变压载水中某些化学物质或元素的含量，以创造压载水内有害细菌与微生物抑制环境来进行压载水处理。
臭氧法。臭氧是一种强氧化剂，在环境中产生氧原子能迅速杀死压载水中的微生物和病原体，而且不存在二次污染问题。但是臭氧处于一种高度不稳定状态，只能通过臭氧发生设备现场制备，费用较高，需要较高的管理维护水平，因此该用于船上压载水处理存在一定困难和问题。
氯化法。该法利用漂白剂、氯气及其衍生物对处理压载水用以去除浮游植物和原生动物以及细菌是可行的，但对于不同的目标生物所需氯含量不同。一般的少量氯对杀死压载水中的细菌有明显效果，而对于浮游藻类，因为耐受性强，需要较高的有效氯含量进行处理。此外，压载水中氯含量过高也会造成二次污染。
压载水处理技术的产业化应用
从原理上分析，能够实现压载水处理的方法与途径较多，但是涉及实际的应用必须考虑效能、装船可行性、运行成本、对船总体的影响等一系列问题。从目前已经开发投入市场的产品分析，基于物理处理法和化学处理法的处理技术设备均有各自的特点，有些技术设备已有较好的装船应用经验，其中，由中远和清华大学联合研制的“海盾”压载水处理系统设备就是成功案例之一。
“海盾”压载水处理系统（如图1）是中远集团下属企业中远造船工业公司和清华大学共同研发的模块化压载水处理系统。该系统历时4年，经开发、设计、样机制作、岸基试验、装船试验、环境评审、功能评审等环节的工作，获得国家专利9项，通过了国际海事组织的初始认可、国家海事局的最终认可，获得了中国船级社的型式认可证书，达到了实船应用水平，通过了科技部验收，入选科技部举办的“十一五国家重大科技成就展”，获得了科技部等四部委共同颁发的“2011年度国家重点新产品”证书。
该船用压载水处理系统注册商标为“海盾（BLUEOCEANSHIELD）”（BOS），是一套综合生物科学、材料科学、流体力学、光学、环境科学、船舶设计等多学科的综合性应用系统，属于全新的创新型科技。海盾压载水管理系统采用纯物理方法的“过滤+紫外”技术路线，首先通过过滤方式去除水体中的50微米以上的生物体，再采取紫外线照射杀灭水体中小于50微米的生物体。该系统是以国际海事组织（IMO）《2004年国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》的要求为基本出发点，综合考虑国际法规、船舶技术方案和生态保护等方面进行设计研发，符合该公约对船舶压载水排放的生物有效性和生态安全性指标要求。该产品具有绿色环保、灭活效果明显、体积小、重量轻、技术先进、可靠性高、技术成熟等优点，技术总体达到国内领先水平、国际相同产品同等水平。
海盾（BOS）系统由全自动反冲洗过滤器（包含反冲洗气瓶）、紫外灭活器（包含紫外电源柜），和集成控制系统三个部分构成。全自动反冲洗过滤器包括一个或多个并联的过滤器单元，并配有一个辅助气瓶。过滤器的职能是去除过流的待处理压载水中50微米以上的颗粒物。过滤器去除大型浮游生物的同时，可以提升待处理压载水的透光率，提高后续紫外灭活的效率。全自动反冲洗过滤器可以在5秒钟内自动完成过滤器的再生，确保水处理的连续性。紫外灭活器包括一个或多个并联的紫外反应器，以及与其配套的紫外电源柜。紫外灭活器的职能是杀灭待处理压载水中的浮游生物和微生物。在完成生物灭活的同时，紫外线对水体的化学成分没有显著影响，是一种安全、高效、环保的水处理手段。集成控制系统包括一个现场控制箱和一系列传感器和执行器件。用户也可以选配一个远程控制箱，用于压载水处理设备的远程控制。集成控制系统的职能包括：人机界面职能、全自动的系统工作过程控制、手动控制职能、设备的故障记录和报警职能、设备运行状况记录职能。在集成控制系统内，过滤器和紫外灭活器以及BOS系统内的阀门实现了协调动作，最大程度地确保了设备的连续稳定运行，降低了操作人员的劳动强度。
在船舶注入压载水期间，海盾（BOS）系统运行在压载模式下（如图2），压载水从海底门由压载泵吸入后，流过过滤器和紫外反应器后，注入压载舱。过滤器利用压载泵提供的压力强制压载水通过过滤器内的过滤面，去除50微米以上的生物体和大颗粒杂质，实现紫外灭活前的预处理。紫外反应器内高强度紫外线直接灭活过滤后压载水内的浮游生物和微生物后，将处理后的压载水注入压载舱。海盾（BOS）系统在压载模式下的工作流程是在全自动状态下协调地完成的，操作人员无需人工参与。在过滤器完成自清洗动作期间，海盾（BOS）系统可以自动调整紫外反应器的运行状态，确保过滤器出水流量的波动不会影响紫外反应器的灭活效果。
在船舶卸载压载水期间，海盾（BOS）系统运行在排载模式下（如图3），压载水经压载泵泵出压载舱后，流过BOS系统内的过滤器旁路，进入紫外反应器做灭活处理，之后通过出海口排到舷外。
基于“海盾”（BOS）良好产品情况，中远造船工业公司与山东威达集团有限公司成立威海中远造船科技有限公司，全面迈开了产品装船应用的步伐，将压载水科技产品产业化落到了实处。截至目前，威海科技的“海盾”压载水处理系统已经完成了30余条船的安装设计方案，涵盖集装箱船、散货轮、油轮、重吊船等船型，并已在中国、希腊、香港等共4条船上完成了实船安装，投入了使用。到目前为止，产品最长的使用期已近2年，从环保性、操控性、方便性、可靠性等方面都取得良好的效果。
【摘要】目的构建红景天苷高转化菌株，并对红景天的固态发酵工艺进行优化。方法以黑曲霉菌株H35和H42为出发菌株，将双亲株的原生质体分别进行紫外和热灭活后进行原生质体融合，通过重氮盐比色法初筛和HPLC复筛得到一融合菌株(Rc14);并运用“复杂定向调控技术”对红景天固态发酵工艺进行优化。结果在最佳固态发酵工艺条件下，Rc14发酵后红景天苷含量比发酵前提高140%，酪醇含量提高277%，总有效成分含量增加了176%。结论利用融合菌株Rc14固态发酵红景天的工艺在红景天的工业生产中具有很高的应用价值。
【关键词】原生质体融合;红景天苷;酪醇;固态发酵
1材料与仪器
1.1菌种黑曲霉(Aspergillusniger)H35和H42，均由本实验室提供。
1.2药材大花红景天RhodiolacrenulataH.Ohba，产自四川省阿坝州，粉碎至80目。
1.3培养基菌丝生长培养基、完全培养基(CM)、高渗CM固体培养基[3]。液体发酵培养基，红景天粉末与水以1∶20比例混合。固态发酵培养基：红景天粉末与水的比例为1∶1.2，添加(NH4)2SO40.1%和KH2PO40.1%。
1.4试剂纤维素酶(Cellulase)、溶菌酶(Lysozyme)、蜗牛酶(Snailase)，用PBA溶解。酪醇标准品、红景天苷标准品购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。
1.5仪器岛津LC-6A高效液相色谱仪。
2方法
2.1原生质体制备及再生参照文献[3]的方法。
2.2双亲灭活及原生质体融合分别将H35和H42菌株的原生质体悬液(×106/ml)进行紫外灭活8min和热灭活(60℃)14min。等量混合灭活后的两亲本原生质体悬液，在32℃下，加入35%PEG融合7min，稀释后涂布于高渗CM平板上，于30℃培养48h。计算融合率。融合率(%)=(A/B)×100%(A为双亲本融合后再生的菌落数;B为灭活前双亲本原生质体再生的菌落数)。
2.3融合子的筛选
2.3.1初筛从再生平板挑出融合菌株，接到红景天液体发酵培养基中，30℃摇瓶培养60h，发酵液用75%的乙醇以1∶8的比例提取，得到粗提液。用重氮盐比色法[4]检测红景天总有效成分。
2.3.2复筛经液态培养后，用HPLC检测发酵粗提液中红景天苷和酪醇的含量[5]。
2.3.3色谱条件高效液相色谱仪色谱柱YWM-C18(10u)4.6mm×200mm;流动相为甲醇∶水=25∶75;波长275nm;柱温25℃;进样量10μl;流速1.0ml/min.。制作红景天苷和酪醇的标准曲线。根据峰面积计算出红景天苷和酪醇的含量。
2.4红景天固态发酵将融合菌株接入红景天固态发酵培养基中，30℃下培养3～4d，用75%的乙醇提取得到发酵粗提液，用于HPLC检测。
3结果
3.1双亲灭活及原生质体融合H35紫外照射8min时，H42在60℃热灭活至14min时，原生质体完全灭活。双亲株原生质体分别采用紫外线和热灭活，损伤部位不同，融合后可以互补。此方法省去对双亲株做遗传标记的过程，简化操作，更易于筛选。灭活后的双亲株在35%PEG-6000，0.01mol/LCaCl2，pH7.5条件下融合，融合子检出率为4.05%。
3.2重氮盐比色法初筛融合菌株从融合平板上挑取菌株48株，重氮盐比色法测定OD486的值，有27株菌能发酵提高红景天有效成分的含量(见表1)。其中有13株菌发酵红景天后，有效成分的含量高于双亲本H35和H42，其中，Rc14和Rc27提高明显。
3.3HPLC复筛以峰面积(Y)与原药材液中红景天苷的量(X)作回归计算，结果显示，红景天苷含量在2.00～12.00μg范围内线性关系好，回归方程为Y=7298287.7394x+7971.7506，r=0.9997(n=6)。表1融合菌株发酵红景天总有效成分的含量
红景天苷的生物合成分为两个阶段：一是苷元的合成;二是苷元和葡萄糖结合形成红景天苷。酪醇的合成途径可能有两条：莽草酸途径和丙二酸途径;红景天苷代谢的两个关键酶：UD葡萄糖基转移酶和B-D-葡萄糖苷酶[6]。菌株H35产合成红景天苷的酶能力较高，H42产合成酪醇的酶的能力相对较强，这两株菌通过融合，合成苷元的酶和合成红景天苷的酶协同互补，合成代谢流显著增强。同时可看出，苷元合成酶的酶活性高于苷合成酶活性，使得苷元的合成量明显高于红景天苷的合成量。融合菌株Rc14传代10次，转化合成红景天苷和苷元的能力未降低，遗传性稳定。
4讨论
在国内外有关提高红景天苷产量的研究中，用愈伤组织培养法合成红景天苷，产量低，为555.13mg/L，且需培养35d[8];以对羟基苯乙酸为原料的化学合成法，操作复杂，产率为63%[9]。利用海藻酸钠和壳聚糖固定β-葡萄糖苷酶，以酪醇和葡萄糖为底物，催化合成红景天苷，成本高，产率为71.9%[10]。而本研究通过微生物转化菌株间原生质体融合构建了红景天苷高产菌株Rc14，红景天苷和总有效成分转化率较前文报道有大幅度的提高，并为需要多步骤合成次级代谢产物途经的微生物转化提供了实例。据本文酪醇含量较高的发酵结果，还有较大的进一步提高空间。本文采用的微生物固态发酵方式设备简单、操作简便、成本低、产量高。经初步测算，扣除发酵生产成本，微生物转化法盈亏平衡点在红景天苷提高15%左右。本研究结果，红景天苷提高140%，已远远超过盈亏平衡点，具备很高的应用价值和经济效益。按红景天苷同等含量计算，原直接醇提法生产工艺的消耗原药材1吨，用融合子Rc14优化后的固态转化工艺，仅用原药材约0.42吨，利润率提高约5倍，野生资源的利用率提高140%，从而实现野生藏中药材的保护性开发。
参考文献
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