CRISPR

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2020.03.21

（1）首先是实验设计

Experimentaldesign1.TargetselectionforsgRNA--选择靶点2.ApproachesforsgRNAconstructionanddelivery.sgRNA的释放方式3.Designofrepairtemplate.设计修复模板4.Clonalisolationofcelllines.分离目的细胞5.Functionaltesting.功能验证

sgRNA的合成和投递有两种方式：A）PCR；B）单独的sgRNA的表达质粒。

优点：ThismethodisoptimalforrapidscreeningofmultiplecandidatesgRNAs,ascelltransfectionsforfunctionaltestingcanbeperformedshortlyafterobtainingthesgRNA-encodingprimers.Becausethissimplemethodobviatestheneedforplasmid-basedcloningandsequenceverification,itiswellsuitedfortestingorco-transfectingalargenumberofsgRNAsforgeneratinglargeknockoutlibrariesorotherscale-sensitiveapplications.快速、简便、研究多。

B）sgRNA表达质粒的方法现在我要用这个方法来举例

优点：ConstructionofanexpressionplasmidforsgRNAisalsosimpleandrapid,involvingasinglecloningstepwithapairofpartiallycomplementaryoligonucleotides.B方法一样高效快捷介绍一下这些质粒：（1）Theoligopairsencodingthe20-ntguidesequencesareannealedandligatedintoaplasmid(pSpCas9(BB))：包含可插入sgRNAtarget序列位点的Cas9的质粒，这个质粒叫做pSpCas9(BB（2）Cas9alone(pSpCas9)：只有Cas9的质粒（3）包含筛选标记的质粒：pSpCas9(BB)-2A-GFPandpSpCas9(BB)-2A-Puro（4）有用于Cas9HDR及DSB的D10Anickasemutant（D10A切口酶突变）的质粒：pSpCas9n(BB)-2A-GFP，pSpCas9n(BB)-2A-Puro)

(b)Schematicforco-transfectionoftheCas9expressionplasmid(pSpCas9)andaPCR-amplifiedU6-drivensgRNAexpressioncassette.(c)SchematicforscarlesscloningoftheguidesequenceoligosintoaplasmidcontainingCas9andthesgRNAscaffold(pSpCas9(BB)).

找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列（2000bp）

找到的序列如下：

系统反馈说我提交的序列和数据中的某基因很像，问我是不是就用下面这个。

选和不选我都试过了，选择的话，得到的引物有两对，如下（摘选了其中一个）：

如果不选的话

error-proneNHEJpathway都说修复方式有两种（1）NHEJ：nonhomologousendjoining，非同源末端结合，这个方式在没有修复模板的情况下发生的。（2）HDR：homology-directedrepair，同源直接修复。这个方式是在有修复模板的情况下。修复模板：（1）plasmid-baseddonorrepairtemplatesthatcontainhomologyarmsflankingthesiteofalteration，也就是有一个供体质粒，质粒有两端同源序列（互补DSB用），两段同源序列之间就是我们要插入或者修改的内容。同源臂通常大于500bp（2）single-strandedDNAoligonucleotides(ssODNs)，emm。。。就是需要两条单链寡核苷酸（ssODN），两臂也是带有同源序列（30~60个碱基，但为了提高效率，最好是大于40个），在Cas9切开双链之后，模板的两臂同源序列直接互补（HDR，同源修复），从而完成了基因编辑。聪不聪明！上传一张自己的理解图

这个很好理解，在编辑片段中加入抗生素抗性基因或者荧光基因后，可通过抗生素筛选或者FACS分离。

Incellsco-transfectedwithapairofsgRNAstomediateagenomic(micro)deletionorinversion,indelmutationscanbedetectedeitherbytheSURVEYORnucleaseassayorbysequencing.OuronlineCRISPRDesignToolprovidesrecommendedprimersforbothapproaches.好了，那么大概的意思就是，咱们想办法检测到indelmutation，也就是检测我们动过的地方，可以使用surveyor核酸酶实验，也可以使用测序（当然这样更好啦）

THE END

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6.7.1最新开发的策略可最大程度地减少CRISPRCas介导的基因组编辑中的脱靶效应

1.13基因敲除实验中常用的gRNA设计网站/软件有哪些？哔哩哔哩

1.转化医学网【Nature子刊】大连医科大学顾春东教授团队:肺癌肿瘤干细胞精准治疗潜在靶点 2024-12-21 15:22 【Cell】肿瘤抑制基因新发现:KEAP1合性成为肺癌预测的关键生物标志物 2024-12-21 15:21 【Nature子刊】复旦大学附属浦东医院王晓亮团队重磅发现:SLC50A1成肝癌新克星 https://www.163.com/dy/media/T1608556126673.html
2.GeneticsNatureCancer genetics Cancer genomics Clinical genetics Consanguinity CRISPR-Cas systems Cytogenetics Development Epigenetics Epigenomics Eukaryote Evolutionary biology Functional genomics Gene expression Gene regulation Genetic association study Genetic hybridization Genetic interaction Genetic linkagehttps://www.nature.com/subjects/genetics/nature
3.SiLCYB调控番茄红素等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用68.1.2、silcyb基因编辑靶点设计 69.根据谷子silcyb基因组序列,通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表,最终选定序列表中序列2第843bp到862bp之间20bp序 列,即5 ′? gcccacaaggatcttcctcg ?3′ 为靶标序列。 70.实施例2、pylcrispr/cas9pubi http://mip.xjishu.com/zhuanli/27/202111177080.html
4.E.coli.CRISPRCas9基因编辑试剂盒(单靶点)(21页)E.coli.CRISPRCas9基因编辑试剂盒(单靶点).PDF,Cat. No.: CR3010-S E.coli. CRISPR/Cas9 基因编辑试剂盒 (单靶点) 产品简介: 本试剂盒采用 CRISPR/Cas9 系统对大肠杆菌基因组进行编辑。可以实现对基因的敲除、 敲入、点突变等。也可以同时对基因组的多个位点进行编辑。https://max.book118.com/html/2019/1125/7103131024002104.shtm
5.sgRNAs&基因编辑sgrna设计网站目前,CRISPR-Cas9基因编辑技术在疾病基础研究、靶点验证、药物分子的高通量筛选、以及遗传性疾病的治疗等领域得到越来越广泛的应用。sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用,其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等,甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此,设计合理有效的sgRNA是实现基因编辑https://blog.csdn.net/geekfocus/article/details/128613082
6.CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤(二)sgRNA的设计及退火因此,我强烈推荐基于重组整合方法设计的CRISPR载体,使用难度低,可靠性强,而且成本上也不会增加。其实验步骤分三步:1、使用XbaI、EcoI等其他稳定可靠的内切酶酶切载体,回收载体;2、使用PCR将靶点做到特定片段上,回收片段;3,重组整合反应,转化即可。 2017-01-29· IP浙江 回复 lixwei20121 请问: BbsI 是不是用于https://3g.dxy.cn/bbs/topic/38427515
7.CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展但与模式植物和一些大作物相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术在非模式植物,尤其在一些小作物的应用中存在如载体构建、靶点设计、脱靶检测、同源重组等问题有待进一步完善。该文对CRISPR/Cas9技术在非模式植物与小作物研究的最新研究进展进行了总结,讨论了该技术目前在非模式植物、小作物应用的局限性,在此基础上提出了相关改进https://www.fx361.com/page/2019/0910/9972311.shtml
8.5个小技巧助您设计CRISPR介导HDR供体DNA企业动态导语:优化实验条件和设计供体 DNA 模板(Donor template)是获得高同源重组修复率的关键。本文将为大家介绍为什么单链供体模板(Single-stranded donor oligonucleotides, ssODN )在 CRISPR 介导的同源重组(Homology directed repair, HDR)表现更优,以及如何设计最佳的 HDR 模板。 https://m.biomart.cn/news/16/2906556.htm
9.iStop基因敲除技术服务稳定细胞系构建大肠杆菌基因编辑服务内容:设计并构建3-5个靶点表达载体,与CRISPRCBE载体一起瞬转HEK293V细胞。基因组PCR测序验证靶点基因敲除效率。提供至少一个有效靶点及有效靶点的sgRNA表达载体。 服务标准: 1、载体测序结果与设计一致。 2、基因组PCR测序结果确定靶点有效。服务适用:本服务适用于尚未设计基因敲除靶点,且有丰富的细胞培养转染、https://www.inovogen.com/geneknockout/CRISPR-Cas9/istop/
10.刘佳课题组构建针对膜蛋白sgRNA设计的CRISPR网站CRISPR近日,上海科技大学免疫化学研究所、生命科学与技术学院刘佳课题组与免疫化学研究所生物医学大数据平台合作,通过升级sgRNA设计的算法,针对已被质谱鉴定的细胞表面蛋白基因设计sgRNA得到膜蛋白组sgRNA文库(CRISPR-Surfaceome),创建了网上数据库CRISPR-Surfaceome(https://crispr-surfaceome.siais.shanghaitech.edu.cn/home)。https://siais.shanghaitech.edu.cn/2022/0815/c5404a767972/page.htm
11.CRISPRCAS蛋白的gRNA序列的设计流程8. 根据网站设计不同的gRNA,选取合适和评分最高的gRNA即可出。 9. 最后在设计好的gRNA序列的5'端点引入酶切位点,合成单链的正反向序列,酶切链接到建好表达载体上, 载体有相同酶切位点。 相关阅读 逆转录PCR/RT-PCR的原理、实验步骤和参数设置 Magigen CRISPR Cas12蛋白家族? https://www.magigen.com/cn/h-nd-674.html
12.(1)引物设计:利用在线网站Design CRISPR guides with off-target and efficiency predictions, for more than 100 genomes.http://crispor.tefor.net/
13.CRISPR/Cas9载体设计与构建的作用机理CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法1:利用试剂盒快速方便地将gRNA 靶点序列插入到Cas9/gRNA 质粒中。构建好的Cas9/gRNA质粒能够同时表达植物密码子优化的Cas9 蛋白及gRNA,应用CRISPR 技术进行目标基因的敲除和编辑。 CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法2:根据NtDXR 基因序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version4.2:选择合适的https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_5909.htm
14.世界首个完全由AI设计的CRISPR基因编辑器来了CRISPR基因编辑是公认的21世纪以来最受关注、最具突破性的生命科学突破,自2012年正式诞生后,短短8年后就获得了诺贝尔奖的认可,去年年底,首款基于CRISPR的基因编辑疗法获得FDA批准上市,用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血,从而开启了遗传疾病治疗的新篇章。 https://m.thepaper.cn/newsDetail_forward_27159623
15.使用指南粒曼CRISPREasyKO试剂盒(RNP法)收藏1.我之前没有做过基因敲除,目前在学习CRISPR/Cas9技术和原理,从头设计gRNA(学习软件/网站),自己构建载体、包装病毒、转染细胞和筛选单克隆和KO纯合子,涉及的技术流程比较复杂,感觉至少需要半年的学习,还不一定能"一次性"成功获得该实验材料(这一步才是刚刚拿到课题的实验材料),费时、费力、费钱; http://www.elem-bio.cn/news_details/28.html
16.基因编辑ThermoFisherScientific完整的 CRISPR 和 TALEN 基因编辑工具包 我们开发了一套完整的基因编辑工具以帮助研究人员探寻和理解基因组如何影响表型,其中包括针对基因编辑工作流程中每个步骤的值得信赖的解决方案。设计用于精确切割、敲入和标记的 CRISPR-Cas9 系统或 TALEN 构建体,将其有效转染到细胞中,并验证基因型和表型结果。我们的已优化并经https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/genome-editing.html
17.医微客因此整理了生物医学、化学、新药研发等常用数据库及网站向大家分享,主要分为以下8大类,欢迎交流补充! 文献检索网站 基因组、蛋白质组数据库 蛋白序列、基因序列、CRISPR工具网站 生信分析工具网站 NovoPro(集大成的在线工具) 化学小分子药物数据库 专利下载数据库 https://www.ewitkey.cn/vipshuo/show-19917.html
18.随机突变文库构建与筛选研究进展在此基础上,Jako?iūnas等扩展了现有的CRISPR技术,采用易错PCR和Cas9介导的基因组整合方法,将大型供体突变体文库整合到单个或多个基因组位点,成功率达到98%–99%[35]。该方法称为CasPER,是Cas9介导蛋白质进化反应的简称。 CasPER包括以下主要步骤(图5):首先,选择合适的DNA突变片段。其次,在目标靶点设计gRNA。http://journals.im.ac.cn/html/cjbcn/2021/1/gc21010163.htm