CRISPRiStop基因敲除系统

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英茂盛业现有超过2000个已验证iStop基因敲除载体，成功编辑细胞株200株，可为您提供从方案设计，靶点筛选及细胞筛选等多种服务。

iStop技术基于CRISPR单碱基基因突变技术CBE（CRISPR-dependentcytosinebaseeditor）。CBE技术在不依赖DNA双链断裂的前提下，特异性实现基因组C>T碱基突变，将CBE技术应用于基因敲除时，可以实现精确地将四个密码子（CAA、CAG、CGA和TGG）转换为终止密码子（TAA、TAG、TGA）。

现有的基因编辑技术，无论是非同源重组的邻端连接法还是同源重组法，都需要先造成DNA双链断裂，导致细胞DNA修复机制发挥作用，从而造成DNA缺失或者外源片段插入。而DNA双链断裂是严重的细胞损伤，会激活广泛的细胞损伤修复机制或者细胞应激甚至死亡。而iStop基因敲除最大的有点在于非常温和，仅改变指定位置的单个碱基，不会造成DNA双链断裂，不影响细胞状态，不造成细胞应激。编辑结果精确可控。

英茂盛业在CBE技术的基础上，通过优化表达结构和sgRNA结构，大幅提高了Cas9蛋白和sgRNA表达效率和编辑效率，仅需要质粒瞬时表达就可实现高效基因编辑。编辑后不残留质粒，不会在细胞基因组插入任何外源DNA和筛选标记，实现真正的无痕基因编辑。

基因编辑流程：

1、iStop基因敲除sgRNA表达载体构建服务编号：SK01服务价格：1800元/靶点周期：2周

服务内容：客户提供靶点序列。我方构建该靶点表达载体。服务标准：载体测序结果与设计一致。服务适用：本服务适用于已有有效靶点的客户。靶点可以来自可靠的文献资料或者客户自己验证的结果。2、iStop基因敲除靶点筛选及载体构建服务服务编号：SK02服务价格：4500元/套周期：4周

服务内容：设计并构建3-5个靶点表达载体，与CRISPRCBE载体一起瞬转HEK293V细胞。基因组PCR测序验证靶点基因敲除效率。提供至少一个有效靶点及有效靶点的sgRNA表达载体。服务标准：1、载体测序结果与设计一致。2、基因组PCR测序结果确定靶点有效。服务适用：本服务适用于尚未设计基因敲除靶点，且有丰富的细胞培养转染、细胞单克隆筛选和检测经验的客户。

3、iStop基因敲除多克隆细胞株服务服务编号：SK03服务价格：8800元/株（HEK293）；9800元/株（常见肿瘤细胞，转染效率大于30%）；其他细胞株询价周期：6-8周

服务内容：前期靶点设计及验证同SK02。验证完成后转染细胞株并用抗生素筛选阳性克隆，基因组PCR测序验证基因敲除效果。提供含基因敲除阳性细胞的细胞pool。服务标准：基因组PCR测序结果确定基因敲除有效。服务适用：本服务适用于尚未设计基因敲除靶点，且有细胞单克隆筛选和检测经验的客户。

4、iStop基因敲除单克隆细胞株服务服务编号：SK04服务价格：14000元/株（HEK293）；18000元/株（常见肿瘤细胞，转染效率大于30%）；其他细胞株询价周期：12-14周

服务内容：筛选多克隆株同SK03。获得多克隆株后通过有限稀释法分选单克隆细胞株。基因组PCR测序检测单克隆株基因敲除结果。提供含目的基因双等位基因敲除单克隆细胞株。服务标准：基因组PCR测序结果验证敲除成功。服务适用：本服务适用于经费充足，实验人手不足的客户。

服务优势：

1)技术成熟。我司具有多年的基因编辑技术经验和稳转细胞株构建服务经验，可提供从项目设计到实施的完整服务。2)已制备多种Cas9蛋白突变体，进一步扩展了CRISPR基因敲除的靶点选择范围，基本上现有基因均可设计iStop基因敲除靶点。

iStop基因敲除实例：在HEK293V细胞株敲除CD274基因

1.靶点设计及筛选

由于CD274基因蛋白仅有274个氨基酸，编码序列较短，采用常规Cas9的NGGPAM序列设计靶点较为困难。我们采用了Cas9的突变体Cas9-spRY进行实验。Cas9-spRY的PAM序列为NRY，大幅增加了可选择的靶点数量。

设计的靶点序列如下：

靶点编号

DNA序列

氨基酸序列

1

编辑前

aaaacaattagacctggctgcac

EKQLDLAA

编辑后（理论）

aaaataattagacctggctgcac

EK*LDLAA

2

ttattcaatttgtgcatggagag

IIQFVHGE

ttatttaatttgtgcatggagag

II*FVHGE

3

aaggttcagcatagtagctacag

KVQHSSYR

aaggtttagcatagtagctacag

KV*HSSYR

4

aaggaccagctctccctgggaaa

KDQLSLGN

aaggattagctctccctgggaaa

KD*LSLGN

2.靶点设计及筛选瞬转HEK293V细胞筛选靶点

构建好的4个靶点表达载体与Cas9-SpRY-CBEMax载体共转染HEK293V细胞。提取细胞基因组，进行PCR测序。结果如下：

THE END

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工具

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6.7.1最新开发的策略可最大程度地减少CRISPRCas介导的基因组编辑中的脱靶效应

1.13基因敲除实验中常用的gRNA设计网站/软件有哪些？哔哩哔哩

1.转化医学网【Nature子刊】大连医科大学顾春东教授团队:肺癌肿瘤干细胞精准治疗潜在靶点 2024-12-21 15:22 【Cell】肿瘤抑制基因新发现:KEAP1合性成为肺癌预测的关键生物标志物 2024-12-21 15:21 【Nature子刊】复旦大学附属浦东医院王晓亮团队重磅发现:SLC50A1成肝癌新克星 https://www.163.com/dy/media/T1608556126673.html
2.GeneticsNatureCancer genetics Cancer genomics Clinical genetics Consanguinity CRISPR-Cas systems Cytogenetics Development Epigenetics Epigenomics Eukaryote Evolutionary biology Functional genomics Gene expression Gene regulation Genetic association study Genetic hybridization Genetic interaction Genetic linkagehttps://www.nature.com/subjects/genetics/nature
3.SiLCYB调控番茄红素等谷子类胡萝卜素合成代谢的功能及应用68.1.2、silcyb基因编辑靶点设计 69.根据谷子silcyb基因组序列,通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表,最终选定序列表中序列2第843bp到862bp之间20bp序 列,即5 ′? gcccacaaggatcttcctcg ?3′ 为靶标序列。 70.实施例2、pylcrispr/cas9pubi http://mip.xjishu.com/zhuanli/27/202111177080.html
4.E.coli.CRISPRCas9基因编辑试剂盒(单靶点)(21页)E.coli.CRISPRCas9基因编辑试剂盒(单靶点).PDF,Cat. No.: CR3010-S E.coli. CRISPR/Cas9 基因编辑试剂盒 (单靶点) 产品简介: 本试剂盒采用 CRISPR/Cas9 系统对大肠杆菌基因组进行编辑。可以实现对基因的敲除、 敲入、点突变等。也可以同时对基因组的多个位点进行编辑。https://max.book118.com/html/2019/1125/7103131024002104.shtm
5.sgRNAs&基因编辑sgrna设计网站目前,CRISPR-Cas9基因编辑技术在疾病基础研究、靶点验证、药物分子的高通量筛选、以及遗传性疾病的治疗等领域得到越来越广泛的应用。sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用,其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等,甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此,设计合理有效的sgRNA是实现基因编辑https://blog.csdn.net/geekfocus/article/details/128613082
6.CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤(二)sgRNA的设计及退火因此,我强烈推荐基于重组整合方法设计的CRISPR载体,使用难度低,可靠性强,而且成本上也不会增加。其实验步骤分三步:1、使用XbaI、EcoI等其他稳定可靠的内切酶酶切载体,回收载体;2、使用PCR将靶点做到特定片段上,回收片段;3,重组整合反应,转化即可。 2017-01-29· IP浙江 回复 lixwei20121 请问: BbsI 是不是用于https://3g.dxy.cn/bbs/topic/38427515
7.CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展但与模式植物和一些大作物相比,CRISPR/Cas9基因编辑技术在非模式植物,尤其在一些小作物的应用中存在如载体构建、靶点设计、脱靶检测、同源重组等问题有待进一步完善。该文对CRISPR/Cas9技术在非模式植物与小作物研究的最新研究进展进行了总结,讨论了该技术目前在非模式植物、小作物应用的局限性,在此基础上提出了相关改进https://www.fx361.com/page/2019/0910/9972311.shtml
8.5个小技巧助您设计CRISPR介导HDR供体DNA企业动态导语:优化实验条件和设计供体 DNA 模板(Donor template)是获得高同源重组修复率的关键。本文将为大家介绍为什么单链供体模板(Single-stranded donor oligonucleotides, ssODN )在 CRISPR 介导的同源重组(Homology directed repair, HDR)表现更优,以及如何设计最佳的 HDR 模板。 https://m.biomart.cn/news/16/2906556.htm
9.iStop基因敲除技术服务稳定细胞系构建大肠杆菌基因编辑服务内容:设计并构建3-5个靶点表达载体,与CRISPRCBE载体一起瞬转HEK293V细胞。基因组PCR测序验证靶点基因敲除效率。提供至少一个有效靶点及有效靶点的sgRNA表达载体。 服务标准: 1、载体测序结果与设计一致。 2、基因组PCR测序结果确定靶点有效。服务适用:本服务适用于尚未设计基因敲除靶点,且有丰富的细胞培养转染、https://www.inovogen.com/geneknockout/CRISPR-Cas9/istop/
10.刘佳课题组构建针对膜蛋白sgRNA设计的CRISPR网站CRISPR近日,上海科技大学免疫化学研究所、生命科学与技术学院刘佳课题组与免疫化学研究所生物医学大数据平台合作,通过升级sgRNA设计的算法,针对已被质谱鉴定的细胞表面蛋白基因设计sgRNA得到膜蛋白组sgRNA文库(CRISPR-Surfaceome),创建了网上数据库CRISPR-Surfaceome(https://crispr-surfaceome.siais.shanghaitech.edu.cn/home)。https://siais.shanghaitech.edu.cn/2022/0815/c5404a767972/page.htm
11.CRISPRCAS蛋白的gRNA序列的设计流程8. 根据网站设计不同的gRNA,选取合适和评分最高的gRNA即可出。 9. 最后在设计好的gRNA序列的5'端点引入酶切位点,合成单链的正反向序列,酶切链接到建好表达载体上, 载体有相同酶切位点。 相关阅读 逆转录PCR/RT-PCR的原理、实验步骤和参数设置 Magigen CRISPR Cas12蛋白家族? https://www.magigen.com/cn/h-nd-674.html
12.(1)引物设计:利用在线网站Design CRISPR guides with off-target and efficiency predictions, for more than 100 genomes.http://crispor.tefor.net/
13.CRISPR/Cas9载体设计与构建的作用机理CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法1:利用试剂盒快速方便地将gRNA 靶点序列插入到Cas9/gRNA 质粒中。构建好的Cas9/gRNA质粒能够同时表达植物密码子优化的Cas9 蛋白及gRNA,应用CRISPR 技术进行目标基因的敲除和编辑。 CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法2:根据NtDXR 基因序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version4.2:选择合适的https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_5909.htm
14.世界首个完全由AI设计的CRISPR基因编辑器来了CRISPR基因编辑是公认的21世纪以来最受关注、最具突破性的生命科学突破,自2012年正式诞生后,短短8年后就获得了诺贝尔奖的认可,去年年底,首款基于CRISPR的基因编辑疗法获得FDA批准上市,用于治疗镰状细胞病和β-地中海贫血,从而开启了遗传疾病治疗的新篇章。 https://m.thepaper.cn/newsDetail_forward_27159623
15.使用指南粒曼CRISPREasyKO试剂盒(RNP法)收藏1.我之前没有做过基因敲除,目前在学习CRISPR/Cas9技术和原理,从头设计gRNA(学习软件/网站),自己构建载体、包装病毒、转染细胞和筛选单克隆和KO纯合子,涉及的技术流程比较复杂,感觉至少需要半年的学习,还不一定能"一次性"成功获得该实验材料(这一步才是刚刚拿到课题的实验材料),费时、费力、费钱; http://www.elem-bio.cn/news_details/28.html
16.基因编辑ThermoFisherScientific完整的 CRISPR 和 TALEN 基因编辑工具包 我们开发了一套完整的基因编辑工具以帮助研究人员探寻和理解基因组如何影响表型,其中包括针对基因编辑工作流程中每个步骤的值得信赖的解决方案。设计用于精确切割、敲入和标记的 CRISPR-Cas9 系统或 TALEN 构建体,将其有效转染到细胞中,并验证基因型和表型结果。我们的已优化并经https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/genome-editing.html
17.医微客因此整理了生物医学、化学、新药研发等常用数据库及网站向大家分享,主要分为以下8大类,欢迎交流补充! 文献检索网站 基因组、蛋白质组数据库 蛋白序列、基因序列、CRISPR工具网站 生信分析工具网站 NovoPro(集大成的在线工具) 化学小分子药物数据库 专利下载数据库 https://www.ewitkey.cn/vipshuo/show-19917.html
18.随机突变文库构建与筛选研究进展在此基础上,Jako?iūnas等扩展了现有的CRISPR技术,采用易错PCR和Cas9介导的基因组整合方法,将大型供体突变体文库整合到单个或多个基因组位点,成功率达到98%–99%[35]。该方法称为CasPER,是Cas9介导蛋白质进化反应的简称。 CasPER包括以下主要步骤(图5):首先,选择合适的DNA突变片段。其次,在目标靶点设计gRNA。http://journals.im.ac.cn/html/cjbcn/2021/1/gc21010163.htm