这篇综述最终展示了迄今为止关于PCa的几个筛选结果。
CRISPR筛选有助于发现前列腺癌的新靶点
关键词：前列腺癌，CRISPR筛选，CRISPR/Cas9
一、简介
此外，与RNAi敲低分析的并排比较揭示了使用CRISPR/Cas9[17]进行功能基因组KO筛选的优势。因此，迄今为止已经进行了许多基于野生型(WT)Cas9的CRISPR-KO筛选。近年来，越来越多的研究还利用了催化死亡Cas9(dCas9)的突变体，其中WTCas9的核酸酶发生突变，使其失去功能[18,19]。dCas9已与一系列染色质修饰融合蛋白融合，将其转化为高度通用的酶，可用于执行CRISPR激活(CRISPRa)或抑制性CRISPR干扰(CRISPRi)筛选[19,20]。
在这篇综述中，将依次讨论不同类型筛选方法（包括方法学）的基本概念，然后进行迄今为止使用此类筛选策略来识别PCa中的靶基因的研究。在整个过程中，我们将讨论了解去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的分子特征并通过基因组研究（例如CRISPR筛选）识别靶标在执行精准医疗和进行临床试验中的重要性。
2.CRISPR筛选方法
示意图概述显示在图1.
图1CRISPR屏幕的示意图。sgRNA文库被转导到感兴趣的细胞中，然后进行表型选择。对于基于活力的筛选，受感染的细胞要么照常培养，要么经受选择性应激（通常是特定药物等）以实现表型。对于标记选择，单元格按FACS排序。随后进行选择，收获基因组DNA，并通过PCR扩增编码的sgRNA并通过NGS鉴定。候选命中由计算算法确定，计算算法提供分数作为每个sgRNA的值。命中按其sgRNA的相对富集分数排序（例如，第0天与第28天，或未选择的对照与选择的样本）。*表示每一步对应的节号。
2.1文库
用于KO筛选的几个合并文库可从浏览源Addgene获得，例如GeCKO、H1/H2、Brunello和TKOCRISPR-KO文库[21、22、23、24]。这些文库包含超过18,000个基因，每个基因有4-10个单向导RNA(sgRNA)。同样，用于激活筛选的CRISPRa和SAM文库以及用于抑制筛选的CRISPRi文库也是共享的[25、26、27]。自定义库对于感兴趣的特定研究很有用[28]。
.2.文库和转导的病毒包装
使用CRISPR/Cas9系统进行混合筛选的第一步是生成一个受sgRNA文库慢病毒感染的受干扰细胞文库。通过将sgRNA文库转染到适当的宿主细胞中来产生病毒，例如具有优异病毒生产能力的HEK293FT细胞。为避免在宿主细胞占用多个sgRNA并针对每个细胞靶向多个基因的情况下产生混淆，通过经验确定病毒滴度来确保低(~0.3)感染复数(MOI)[27、29、30]。重要的是要注意这一步的局限性——一些模型，如PCa的NCI-H660和VCAP细胞，使得通过慢病毒方法实施工具变得非常具有挑战性。
2.3.基于生存能力的筛选
最终，单个筛选可以导致阳性和阴性选择的表型。例如，癌细胞系的基于活力的KO筛选可以揭示癌基因的消耗和肿瘤抑制因子的富集。通常，中等剂量的小分子可以识别致敏基因和抗性基因[46]。
2.4.标记选择屏幕
标记选择筛选旨在识别影响特定报告分子表达的遗传元件，表型不是基于细胞活力，而是基于影响标记蛋白表达的突变。在这种类型的筛选中，可以通过用荧光标记替换感兴趣基因的编码序列来对报告基因进行基因工程。最终，荧光激活细胞分选(FACS)允许通过对具有影响标记表达的sgRNA靶向基因的细胞进行分选来识别上游表达调节因子[27,47]。
2.5.分析（算法）
在选择步骤之后，从存活的细胞或FACS选择的细胞中收集DNA，并使用PCR从细胞群中分离基因组DNA并读取负责表型的基因。随后，使用下一代测序(NGS)进行大规模并行测序，以覆盖编码sgRNA的区域。现有的几种算法，例如基于模型的全基因组CRISPR/Cas9KO分析(MAGeCK)[48,49,50],edgeR[51],基因本质的贝叶斯分析(BAGEL)[52],CRISPRAnalyzeRforPooledScreens(caRpools)[53]，使用Python(PinAPL-Py)[54]和DrugZ[[55]然后可用于通过检查对照和表型样品之间sgRNA丰度的差异来确定负责观察到的表型的候选基因。
2.6.验证
筛选分析提供了导致表型的候选基因的排序列表。为了评估哪些基因对表型有贡献以及有多少，验证是必不可少的。最关键的验证方法是通过引入靶向感兴趣基因的sgRNA来评估所选表型是否确实可重现。近期对sgRNA特异性的改进减轻了确认与靶标结合的需要，只要针对同一遗传元件的多个sgRNA引发表型。
但是，如果需要，可以进行基因组PCR、RT-qPCR和蛋白质印迹等分析来评估目标基因的功能修饰[25,27]。重要的是要注意，对目标活动的确认并不排除由于脱靶效应而产生表型的可能性。因此，不仅使用具有最高靶向活性的一个sgRNA还使用每个基因的多个sgRNA对表型进行连续验证实验是至关重要的。拯救实验是另一种确认遗传实体是否赋予表型的方法。目标是确认在CRISPR/Cas9编辑的细胞中将候选表达恢复到生理水平是否会使细胞恢复到它们的野生型状态。
3.PCa中的CRISPR筛选
迄今为止，已在PCa中报告了几种CRISPR筛选。本节将介绍每种屏幕类型的分类结果（表格1）。
3.1发现潜在目标
达斯等人。在转移性PCa模型中进行了第一次基因组规模的CRISPRi筛选，以确定细胞存活所需的基因[62]。他们证明，驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)和WD重复域62(WDR62)在体外和体内促进侵袭性PCa表型，从而将KIF4A和WDR62提名为PCa驱动基因，并结合其临床数据。标记选择筛选，一种基于CRISPR的E3连接酶筛选方法在DsRed/EGFP-PDK1报告基因HKT细胞中由Jian等人进行。发现Cullin3SPOPE3连接酶促进PDK1泛素化和随后的降解[63]。值得注意的是，大约15%的SPOP突变已在PCa环境中发现[64、65、66]。他们使用PCa细胞系进行了研究，其中SPOP以CK1/GSK3β介导的磷酸化和degron依赖性方式识别PDK1。无论是SPOP的功能缺失突变还是其结合区PDK1的功能获得突变都减弱了SPOP对PDK1的识别和泛素化，导致PDK1蛋白丰度、AKT激酶活性升高和肿瘤恶性肿瘤的益处，表明PDK1-AKT通路将成为突变的SPOP或PDK1驱动的PCa的潜在靶标。
3.2.发现药物诱导的合成杀伤力靶点和耐药机制
雷等人。进行了激酶组规模的CRISPR/Cas9筛选，并确定细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)对PCa细胞活力至关重要[69]。CDK12抑制剂THZ531具有显着的抗肿瘤作用。从机制上讲，THZ531下调AR信号并优先抑制CDK12抑制敏感转录本(CDK12-ISTs)。此外，他们发现THZ531与多种AR拮抗剂显示出显着的协同作用。利用临床合成致死率靶向DDR通路的药物已经在几种类型的癌症中表现出治疗益处[77,78]。奥拉帕尼还显示出对DDR缺陷患者转移性PCa的益处，将潜在的反应生物标志物扩展到BRCA[9,10]。其他旨在抑制DDR的分子和药物组合，如ATR、ATM、CHK1和DNA-PK，也得到了很好的研究[79,80,81,82,83]。齐默尔曼等人。在广泛的三种不同细胞系（Hela、RPE-hTERT和SUM149PT）中使用PARP抑制剂奥拉帕尼治疗进行了CRISPR-KO筛选，并呈现了一组高可信度的73个基因，这些基因在发生突变时会导致对PARP抑制剂的敏感性增加[70]。最后，他们发现核糖核酸酶H2(RNASEH2)的缺失使细胞对PARP抑制敏感，从而阻碍缺乏核糖核酸酶H2的细胞中的核糖核苷酸切除修复，导致PARP捕获损伤，损害DNA复制并损害基因组完整性。值得注意的是，RNASEH2还通过另一个CRISPR-KO筛选确定了导致ATR抑制剂合成致死性的缺失[71]。
为了确定赋予治疗抗性的新因素，Chu等人。在用ADI处理的ADI抗性M231细胞中进行了全基因组CRISPR-KO筛选，并通过激活AKT/mTOR/STAT3/CCL2途径，结合RNA-seq分析确定TREM-CCL2途径是抗性的关键因素[73]。他们还在PC3PCa细胞模型中进一步验证了结果。本研究揭示了ADI耐药的新途径，并为克服乳腺癌和PCa中的ADI耐药提供了新的靶点。
4.结论
关于本文介绍的筛选中的新目标，有必要在不久的将来对PCa患者进行进一步研究。我们通过基因组研究（例如CRISPR筛选）对CRPC分子特征的了解将以增加分子测试的形式应用于临床，以增加药物使用和临床试验资格。因此，CRPC患者将越来越多地受益于我们对基因组改变在PCa病因学中的作用以及治疗具有特定突变的患者的潜力的理解。
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