CRISPR/Cas9-basedgenomeeditingtechnology
ArobustCRISPR/Cas9vectorsystemformultiplextargetingof
genomicsitesinmonocotanddicotplants
亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室
华南农业大学生命科学学院
刘耀光课题组
(**************.cn)
1.pYLCRISPR/Cas9多靶点载体介绍
CRISPR/Cas9是新近发展的基因组编辑技术（图1）。CRISPR/Cas9切割靶序列仅需要single-guideRNA(sgRNA)以及由sgRNA引导的Cas9蛋白，比锌指核酸酶（ZFNs），TALENs更加简便，高效，因而成为基因组编辑工具的首选。
我们利用CRISPR/Cas9技术可方便地进行多重靶向的特征，构建了一套用于单子叶和双子叶植物的多靶点CRISPR/Cas9基因打靶载体系统。
本套载体将Cas9蛋白表达盒整合到双元载体上，用于装载多个sgRNA表达盒的多克隆位点BsaI位于靠近双元载体RB位置。sgRNA表达盒元件设在中间质粒载体上，利用酶切连接和PCR方法拼装好，再利用GoldenGate或GibsonAssembly克隆方法组装到双元载体上。本载体系统已经发表（Maetal.,2015,MolecularPlant,DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007）。5’NNNNNNNNNNNNGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTargetSite
PAMNNNNNNNNNNNN-3’3’NNNNNNNNNNNNNCCNNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN5’-G/ANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAACGAUAGAA
AACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUUCas9
nucleaseCleavagesitegenome
sequence
RuvC-likedomainHNHdomainCUUGAAAAAGUGGCACCGAGCGUGGCUUUUUU-3’NGG
Figure1.AworkingmodeloftheCRISPR/Cas9system.TheCas9-sgRNAcomplexlocatestothetargetsitetocleavetheDNAtoproducedoublestrandbreak(DSB).
2．CRISPR/Cas9载体与sgRNA载体图谱
2.1CRISPR/Cas9双元载体
本套载体系统的双元载体骨架为pCAMBIA-1300(ACCESSION:AF234296)，Cas9p为本实验室设计合成的植物优化密码子基因，它模拟了禾本科植物基因具有5’端GC含量较高的特征(Figure2)。
这些质粒在E.coliTOP10F’(LacIq)菌株繁殖，该菌株LacIq基因型产生的阻碍蛋白可抑制ccdB大肠杆菌致死基因的表达。
我们对pYLCRISPR/Cas9载体采用了新的命名，与旧的命名对应关系见表1。
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B载体中的Cas9p用PUbi驱动，优选用于单子叶植物的基因打靶；对于双子叶植物，我们前期使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H在拟南芥获得了uniform简单突变（双等位突变，杂合突变，纯合突变）以及嵌合突变（Maetal.,2015）。但是，我们最近发现用pYLCRISPR/Cas9Pubi-H在拟南芥的打靶效果效率比使用pYLCRISPR/Cas9P35S-H的效果效率更高，能得到更多的简单突变。因此也推荐在双子叶植物优先使用PUbi驱动Cas9p的载体pYLCRISPR/Cas9P35S-H或pYLCRISPR/Cas9P35S-B。
Figure2.ACRISPR/Cas9systemfor
monocotanddicotplants.
pYLCRISPR/Cas9Pubi-H,-B(above);
pYLCRISPR/Cas9P35S-H,-N,-B(below);
HPT(-H),Bar(-B),andNPTII(-N)
encodehygromycinBphosphotransferase,
PPTacetyltransferaseandneomycin
phosphotransferaseII,respectively.NLS,
nuclearlocalizationsequence.Thekey
sequencesincludingrestrictionsitesfor
cloningandanalysisofsgRNAexpression
cassettesaregiven.TwoBsaI-cuttingsties
[BsaI(B-L)andBsaI(B-R)]forcloning
thesgRNAexpressioncassettesareseparatedbyashortenformoftheccdBnegativeselectiongene.
表一pYLCRISPR/Cas9载体新旧命名对应关系
新命名原命名适用植物种植物抗性
单子叶/双子叶潮霉素pYLCRISPR/Cas9Pubi-HpYLCRISPR/Cas9-MH,
pYLCRISPR/Cas9-MTmono
pYLCRISPR/Cas9Pubi-BpYLCRISPR/Cas9-MB单子叶/双子叶草甘磷
pYLCRISPR/Cas9P35S-HpYLCRISPR/Cas9-DH双子叶潮霉素
pYLCRISPR/Cas9P35S-BpYLCRISPR/Cas9-DB双子叶草甘磷
pYLCRISPR/Cas9P35S-NpYLCRISPR/Cas9-DN双子叶卡那霉素
2.2CRISPR/sgRNAvectors
sgRNA序列全长97nt，分为两部分，5’决定靶序列的20nt(seedsequence)和3’区域为保守的结构序列。因此构建针对特定靶位点的sgRNA，只需要克隆决定靶序列的5’端20nt。sgRNA用smallnuclear(sn)RNAU6/U3启动子驱动，以保证转录出的sgRNA停留在细胞核中与Cas9结合。
本方案用PCR扩增的方法构建包含靶序列的sgRNA表达盒，并在扩增引物5’端引入顺次排列的位置特异BsaI酶切位点，用于GoldenGate克隆。或在扩增引物5’端加入互补序列用于GibsonAssembly连接克隆。
为了提高构建好的多靶点载体的稳定性，避免在农杆菌或者植物基因组中sgRNA表达盒之间发生同源重组，从水稻克隆了4个不同snRNA启动子(OsU3,OsU6a，OsU6b，OsU6c)，用于单子叶植物；从拟南芥中克隆了4个不同snRNA启动子（AtU3b，AtU3d，AtU6-1，AtU6-29），用于双子叶植物。
Figure3．(A)OverallstructureofeightbasicsgRNAintermediatevectors.(B)ThetwoBsaIcuttingsequencesaregivenintwelvesgRNAvectors(inalinearform),includingotherfourvectors