摘要：心肌梗死引起的大量心肌细胞损失导致心脏病理性重构和心力衰竭的发生，如何促进心肌再生是修复受损心脏的关键问题。心肌细胞再生主要源于原有心肌细胞的增殖已被广泛认同。近年来，该领域的快速发展加深了我们对心肌细胞再生的内源性细胞和微环境特征、外源性影响因素、分子生物学机制以及干预策略等各方面的认识。因此，我们对哺乳动物心肌细胞再生的定义、特征、评价和研究方法、调控机制以及干预措施等进行整理并形成共识，旨在明确该领域尚需进一步阐明的重要问题，推动心肌再生研究的深化及其在临床上的应用转化。
心肌梗死(myocardialinfarction,MI)引起的大量心肌细胞丢失导致心脏病理性重构和心力衰竭的发生，如何促进心肌再生是修复受损心脏的关键问题，也是生物医学研究的前沿和热点问题。类似的再生医学挑战同样存在于其他重要领域。例如在神经科学方面，研究人员对如何有效促进神经元和神经组织再生以治疗神经退行性疾病和神经损伤进行了积极探索。这些努力显示了再生医学在生物医学研究中的广泛应用和重要性。经过近20年的探索，心肌细胞再生主要源于原有心肌细胞的增殖已经得到广泛共识。近年来该领域研究的迅猛发展使人们对心肌细胞再生有了更深入的认识。心肌细胞再生的内源性细胞和微环境特征、外源性影响因素，以及分子生物学机制和干预策略等方面的知识在不断地更新和丰富。因此，我们认为有必要对哺乳动物心肌细胞再生的定义、特征、评价和研究方法、调控机制和干预策略等进行梳理，形成共识，并明确尚需进一步阐明的重要问题，以推动该领域研究的进一步深化和转化应用。
一、心肌细胞再生研究变迁
传统观点认为，成年哺乳动物的心肌细胞是终末分化细胞，不具有增殖或自我更新的能力，个体成熟后心肌细胞数量保持不变。因此，MI发生后，心肌难以自我修复。
二、心肌细胞再生定义
成年心肌细胞再生经历一系列特征性步骤，即去分化、增殖和再分化[8]，整个过程涉及到结构、功能及基因表达的动态变化。去分化是指相对成熟心肌细胞在形态、细胞结构、表达谱及功能等方面向幼稚阶段心肌细胞转变，表现为肌小节结构的解聚、线粒体的排出或减少、兴奋-收缩解耦联，以及呈现接近于胚胎期未成熟心肌细胞的表达谱，例如重新表达Runx1、α-SMA、Dab2、Gata4、Nkx2.5等胚胎期基因[16,17]。去分化被认为是成年心肌细胞发生增殖的必经步骤，为心肌细胞增殖提供全方位的准备。
心肌细胞增殖过程指心肌细胞重新进入细胞周期，经历有丝分裂并最终形成新的子代心肌细胞。尽管成年心肌细胞可重新进入细胞周期，但最终完成有丝分裂的比例却极低，多数细胞代之以“多核化”或“多倍体化”，即细胞核复制但不发生胞质分裂，或仅发生DNA复制。增殖后的子代心肌细胞由于各方面仍处于相对幼稚状态，尚不能与周围成熟心肌整合并参与收缩。
再分化过程指增殖后的子代心肌细胞，在基因表达、形态和功能上由相对幼稚状态重新向成熟心肌细胞分化，最终重新获得肌小节结构，与周围成熟心肌细胞建立细胞间连接，恢复兴奋-收缩耦联及正常收缩功能的过程。心肌细胞的去分化、增殖及再分化是心肌细胞再生所必经的动态过程，全面认识该过程有助于推动心肌细胞再生研究及应用转化。
三、增殖心肌细胞的特征及研究方法
具有增殖能力，或正在发生增殖的心肌细胞相较非增殖心肌细胞在细胞形态、结构、电生理、基因表达谱和代谢方式等方面表现出明显的特征。通过对这些特征进行深入研究和干预，有望寻找到促进心肌细胞增殖的关键靶点和方法。
1增殖心肌细胞的特征
1.1结构特征
1.1.1肌小节/细胞骨架蛋白
从哺乳动物胚胎期、出生后到成年阶段，伴随着心肌增殖能力的减退，心肌细胞的肌小节结构逐渐成熟，其特征为肌纤维数量和密度的增加，肌小节排列更加有序，肌小节结构蛋白的构成更加复杂。相反，新生个体心肌细胞通常体积较小，肌小节等内部结构缺乏有序排列。肌小节结构的解聚是心肌细胞发生增殖的前提，所有观察到的正在进行有丝分裂的心肌细胞都显示出肌纤维排列的紊乱，肌小节结构的消失，该过程涉及一系列肌动蛋白的解聚[18]。这些结构改变究竟是心肌细胞增殖的诱因，还是仅为心肌细胞增殖的固有步骤，尚有待进一步阐明。有研究报道，干预肌动蛋白的聚合调控心肌细胞增殖：增殖心肌细胞与非增殖心肌细胞相比，单体形式的G-actin水平升高而聚合形式的F-actin水平减少，抑制G-actin聚合为F-actin，可促进心肌细胞的去分化-增殖-再分化[19]。针对其他骨架蛋白/肌动蛋白的干预研究有助进一步探索细胞结构变化与心肌细胞增殖的关系。
1.1.2核型/多倍体型
1.1.3线粒体结构与功能
1.2基因表达谱特征
scRNA-seq同样运用于研究大动物心肌再生。通过对P1心尖切除的猪心肌组织进行单个细胞核测序，分析得到了6个不同的心肌细胞亚群。其中两个心肌细胞亚群(CM4和CM5)的细胞周期基因的表达和心肌细胞增殖能力显著增加，参与心肌损伤后的再生。受限于细胞体积的限制，该结果未包含细胞质RNA数据[29]。
1.3电生理特性
1.4代谢特征
2心肌细胞再生的评价与研究方法
2.1研究心肌细胞再生的动物模型
2.1.1心尖切除模型
心尖切除手术是在新生个体的心尖部位切除约15%～20%的左心室心肌组织，主要用于研究心肌组织的再生能力。心尖切除手术一般在P1和P7/P8小鼠心脏进行，以检测心肌再生能力是否足以修复受损心肌[37]。结果显示，在P1小鼠中，心肌在心尖切除术后的21天内几乎完全修复，而在P7小鼠中，心肌无法再生并发展为显著的纤维化。这一发现，使得在新生小鼠、大鼠进行心尖切除手术成为了研究心肌增殖的典型模型[8,38]。
心尖切除手术同样可成功地应用于新生猪的实验模型。其具体操作为，通过胸骨正中线切开暴露新生猪的心脏，并从心尖部切除4～5mm的心肌组织。值得注意的是，在P1接受心尖切除手术的新生猪，在P28再次接受MI手术时，与对照组相比显示出更为显著的心肌再生能力。该模型进一步证实了心尖切除手术对心肌增殖能力的刺激效果[39]。
2.1.2冷冻损伤模型
2.1.3MI模型
MI模型是对冠状动脉进行永久性结扎，造成心肌缺血损伤，以模拟临床MI病理状态的实验模型。在P1小鼠心脏诱导的MI模型同样可刺激心肌再生[37]。P1新生小鼠的心脏在MI后第21天进行检测，可观察到类似于心尖切除模型的自我修复，相反，P8小鼠心脏在MI后则表现出广泛的纤维化、心壁变薄和心室扩张。对P1新生猪进行永久性的冠状动脉结扎，发现其心脏能够完全再生并持续恢复心脏功能，而在P7进行冠状动脉结扎的猪则发展出完全的心肌瘢痕和变薄的心壁[11]，表明MI同样是新生个体心肌损伤的有效模型。
成年小鼠在MI后，梗死边缘区重新进入细胞周期的心肌细胞明显增加，表现为Ki67、磷酸化组蛋白H3(phospho-histoneH3,PH3)、AuroraB、BrdU和EdU等增殖标志物阳性的心肌细胞数目增多[41]。成年小鼠MI模型可用于检测特定干预措施对心肌增殖能力的影响。
2.1.4心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型
在猪等大动物模型，通过冠状动脉球囊封堵的方法建立的I/R损伤模型同样被用于检测刺激心肌细胞增殖的治疗效果，例如在猪的I/R模型中，前降支内给与重组Agrin可刺激成年心肌细胞重回细胞周期，并将梗死面积缩小约50%[43]。
2.1.5压力负荷模型
2.2心肌细胞再生的检测方法和研究体系
为了评估和研究心肌细胞的再生能力，研究者们开发了一系列技术方法和研究体系。这些方法包括分离心肌细胞计数、活细胞工作站的应用、细胞周期标志物的免疫染色、MIMS技术、谱系示踪技术、以及各种测序与组学技术的应用。每种技术既有其独特的优势，同时也存在相应的局限性。这些研究工具和方法为我们研究心肌细胞再生提供了重要基础(表1)。
2.2.1分离心肌细胞计数
将胶原酶/胰酶通过Langendorff系统进行主动脉逆行灌注，以消化分离心肌细胞，制备细胞悬液并计数，估算其绝对心肌细胞数量的方法，也被用于评估心肌细胞增殖。但该方法依赖于操作人员的熟练度和可重复性，以最大限度保证分离心肌细胞的活性/数目具有可比性。此外，在小鼠MI模型中，存在因部分心肌灌注不完全、前降支血管结扎位置、梗死面积个体差异导致心肌细胞绝对计数不同的可能。
2.2.2活细胞工作站
通过将荧光蛋白(例如tdTomato)标记的成年心肌细胞与一定比例的新生乳鼠心室肌细胞(neonatalratventricularmyocytes,NRVMs)进行共培养，并联合延时摄像(timelapsevideo)技术，可实现对体外培养成年心肌细胞命运，特别是胞质分裂的全程示踪。该系统发现成年心肌细胞在体外的增殖比例可达7%。利用活细胞核染料Draq5对成年心肌细胞核数目进行标记，并测算心肌细胞初始大小，该系统还发现不同细胞核数目(单核/多核)以及不同大小心肌细胞的增殖能力并无明显差异。通过对完成胞质分裂的子代心肌细胞进行cTnI等心肌标志物染色，该系统发现并非所有子代心肌细胞都能重新表达cTnI，在cTnI阳性的子代细胞中，仅有部分可获得肌小节的重新排列，表明增殖后的子代心肌细胞并不能完全获得重新分化。该技术还被用于检验心肌增殖标志物的可靠性[16]。
2.2.3细胞周期标志物的免疫染色
2.2.3.1Ki67、PH3、AuroraB
Ki67抗原最初是在二十世纪八十年代初由Gerdes和他的同事们发现，他们使用一种来自霍奇金淋巴瘤细胞系的核抗原的小鼠单克隆抗体进行了研究。这种蛋白质的命名是根据研究者的所在地来的，Ki代表着德国基尔大学(KielUniversity)，而67则表示96孔板上的克隆编号[46]。Ki67在非G0期(非休眠期)，即细胞周期G1、S、G2和M期中广泛表达，因此Ki67蛋白可被用来标记细胞是否正在活跃地进行DNA复制和是否进入细胞周期。
PH3是在第10位丝氨酸(Ser10)位置上发生磷酸化的组蛋白H3。PH3是一种M期特异的标志物，尤其是在有丝分裂过程中的前期和中期。因此，检测PH3可作为评估细胞处于有丝分裂过程中的有效方法。
AuroraB也称为“AurorakinaseB”，属于极光激酶(Aurorakinases)家族的一员。Aurorakinases最早是在果蝇中被发现，其突变导致细胞在有丝分裂过程中，中心小体不能正常分离，出现单极纺锤体而得名。AuroraB在细胞有丝分裂的各个阶段，特别是在染色体的分离和纺锤体的形成中发挥重要的调控作用，因此其功能对细胞分裂的顺利进行至关重要。AuroraB的表达和活性在M期达到高峰，并具有特征性的定位。在有丝分裂后期至终末期，AuroraB从着丝粒移向中心体，参与胞质分裂。因此，AuroraB被用于检测心肌细胞有丝分裂/胞质分裂[18]。
2.2.3.2BrdU/EdU染色
5-溴-2'-脱氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)和5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine,EdU)是两种合成的核苷类似物。它们可以被细胞摄取并嵌入到新合成的DNA中，因此被广泛用于标记正在合成DNA的细胞，从而检测心肌细胞增殖。然后，由于心肌细胞DNA复制并不代表细胞增殖，并且DNA修复也会导致BrdU/EdU阳性，因此单独使用该指标评估心肌细胞增殖可能并不准确，一般需联合其它指标或谱系示踪技术。BrdU/EdU检测不仅可以在组织切片中进行，还可以通过胰酶/胶原酶对全心进行消化制备心肌细胞悬液进行。BrdU/EdU阳性的单核心肌细胞被认为更可能是增殖的心肌细胞[18]。
2.2.3.3细胞周期标记与心肌特异性标记的联合应用
在心脏组织切片中，确定细胞周期标记阳性的细胞核是属于心肌细胞还是相邻的间质细胞具有一定难度。通过共染色技术，可显著提高标记心肌细胞的准确性。例如，使用小麦胚芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)染色来环绕细胞膜，以及使用心肌细胞核的特异性标记，如PCM1、Nkx2.5、MEF2和GATA4，都可明显提高标记细胞周期活跃的心肌细胞的准确性[47]。
2.2.4MIMS技术
MIMS是结合了离子显微镜和质谱的高分辨率成像技术。在给与小鼠15N同位素标记的胸腺嘧啶(15N-thymidine)标记DNA复制后，MIMS可以小于一微米立方的精度，定量分析15N:14N比值并生成高空间分辨率图像。
2.2.5谱系示踪技术
通过谱系示踪技术，利用心脏特异性的Cre/Dre重组酶对心肌细胞进行标记，是研究在体心肌细胞增殖的强大工具。目前已经成功开发了多种小鼠模型，用于跟踪心脏发育过程中或损伤后的心肌增殖(图1)。值得注意的是，谱系示踪常用的Cre-loxP系统需设立严格的对照，有研究报道Myh6-MerCreMer或Myh6-Cre在诱导后即使在没有loxP位点存在的情况下，亦可导致心肌细胞DNA损伤以及心功能下降。因此，在研究中设置合适的对照具有必要性[49]。
2.2.5.1FUCCI报告基因鼠
荧光泛素化细胞周期示踪系统(fluorescentubiquitination-basedcellcycleindicator,FUCCI)使用两个荧光探针，即橙色荧光蛋白Kusabira-Orange(mKO)和绿色荧光蛋白Azami-Green(AzG)。在FUCCI系统中，mKO与细胞周期G1期指示蛋白hCdt1融合，而AzG与S/G2/M期指示蛋白Geminin融合。在细胞周期进程中，由泛素化介导的mKO-Cdt1和AzG-Geminin之间的交替使得从G1期到M期的细胞周期阶段可直接可视化[43]。FUCCI报告鼠可以与αMHC-Cre鼠繁育，从而生成心肌特异性的FUCCI系统，以反映心肌细胞的细胞周期进程[50](图1A)。
2.2.5.2eGFP-Anillin小鼠
在eGFP-Anillin小鼠中，eGFP-Anillin融合蛋白在Myh6启动子的控制下表达，从而实现对M期心肌细胞的可视化。通过Anillin在中心体是否呈对称分布，以及距离姊妹待分离细胞的远近两个标准，有助于区分心肌细胞的胞质分裂和多核化[51](图1B)。
2.2.5.3Aurkb-tdTomato小鼠
Aurkb-tdTomato小鼠通过Aurkb的表达同步、实时标记增殖心肌细胞。由于Aurkb表达在M期间达到顶峰，该工具能够标记M期活跃的心肌细胞，与Ki67相比更接近于细胞分裂。该系统利用Tnnt2驱动表达的Dre，将Aurkb(promoter)-rox-Stop-roxtdTomato的Stop序列剪切，形成Aurkb(promoter)-rox-tdTomato，使任何表达Aurkb的细胞均同步表达tdTomato。体外共培养系统结合实时延时成像显示，94.44%的tdTomato+P1心肌细胞经历了完整的胞质分裂。该系统揭示在P1小鼠心脏中，tdTomato+心肌细胞占左心室总心肌细胞数的3.92%，在P7的心脏中减少到1.57%，在成年心脏中降至0.1%～0.2%。此外，P1新生小鼠的心尖切除损伤增加了tdTomato+心肌细胞的数量，但成年小鼠MI却并未增加心脏tdTomato+心肌细胞数[52](图1C)。
图1.研究心肌细胞增殖的谱系追踪小鼠模型。
2.2.5.4ProTracer小鼠
ProTracer系统发现，小鼠出生后心肌细胞增殖虽持续下降，但仍持续至青春期前[53]；验证了成年小鼠每年的心肌增殖比率约为4.4%；此外，它还显示成年小鼠MI后，梗死区和梗死边缘区的心肌细胞进入细胞周期，而这些心肌细胞显示出空间特异性，高度局限于左心室心内膜下心肌。通过连续心脏切片，ProTracer系统还揭示了约13%被Ki67标记的成年心肌细胞最终完成分裂[41](图1D)。
2.2.5.5Rainbow小鼠
2.2.5.6αDKRC/RLTG小鼠
αMHC-MerDreMer-Ki67p-RoxedCre(αDKRC)::Rox-Lox-tdTomato-eGFP(RLTG)小鼠在Tamoxifen诱导后可将全部心肌细胞标记为tdTomato，而此后发生增殖的心肌细胞由tdTomato变为eGFP。
该系统利用Dre-rox与Cre-loxP双重诱导。诱导后的Dre将所有心肌细胞标记为tdTomato，并同时剪切掉Ki67promoter-Cre(N-terminus)-rox-Stop-roxCre(C-terminus)中的Stop序列，使得全长Cre可在Ki67启动子驱动下得以表达。Cre剪切掉位于eGFP前的loxP-tdTomato-Stop-loxP序列后，使细胞由表达tdTomato变为表达eGFP[42]。
根据eGFP阳性的心肌细胞单个分布还是形成集落，可协助判断进入细胞周期的心肌细胞是否发生增殖。成年αDKRC/RTLG小鼠在心肌I/R损伤后，eGFP阳性心肌细胞是假手术组的3.5倍，但单个eGFP与成对eGFP心肌细胞的比例为9:1，表明心肌损伤后Ki67阳性的心肌细胞仅有少部分完成增殖[42](图1F)。
2.2.5.7双标记嵌合分析(mosaicanalysiswithdoublemarkers,MADM)小鼠
MADM小鼠模型可明确地识别增殖后心肌细胞。MADM小鼠由MADM-GT与MADM-TG小鼠杂交而得，GT与TG代表红色/绿色荧光蛋白非全长片段的排列顺序。在该模型中，编码非全长荧光蛋白(如RFP和GFP)片段的DNA被整合到基因组，细胞在S期进行DNA复制后，由于染色体间的Cre-loxP同源重组，可导致分裂后的两个子细胞分别具有不同颜色的全长荧光蛋白标记(GFP或RFP)。因此，每当一个细胞分裂，它的两个子细胞将被明确地、永久地标记。
该模型的明显优势是单色的细胞无可争议地表明是已经分裂的心肌细胞。该模型同样存在局限性，由于染色体间重组的随机性，不是所有分裂的子细胞都会被标记为单一颜色，因此可能低估了真实的增殖率。在小鼠出生后第一周，11%的标记细胞表达单色荧光蛋白，而到3个月时这个数字减少到2.5%。在该模型中，MI后第4周并没有观察到明显的成年心肌细胞增殖。转录组测序结果提示，增殖后子代心肌细胞的表达谱特征更接近成年心肌细胞，而不是新生心肌细胞，表明这些子代细胞发生了再分化[13](图1G)。
2.2.5.8CyclinA2-LacZ-floxed-EGFP小鼠
CyclinA2是表达于G1中期-M期中期的细胞周期蛋白。该工具小鼠将LacZ-floxed-EGFP序列构建到CyclinA2基因座，与CyclinA2形成融合蛋白，使细胞表达CyclinA2-β-gal。在与TroponinT-Cre小鼠杂交后，可由心肌细胞特异性表达的Cre将LacZ-floxed剪切，从而表达CyclinA2-EGFP，标记进入细胞周期的心肌细胞。与FUCCI小鼠相比，该系统使用单色荧光，更有利于多重染色。利用该系统，研究者揭示了在P0～P1小鼠，右心室CyclinA2-EGFP阳性的心肌细胞比例少于左心室；此外，小鼠在P15并没有再次出现心肌细胞增殖的高峰[56]，这与Husain团队关于小鼠在青春前期(P15)出现心肌细胞增殖高峰的报道相反[57]。
2.2.6空间转录组学
尽管单细胞测序可在细胞水平提供不同细胞亚群的详细信息，但这些细胞在空间解剖上如何分布却并不清楚。利用空间转录组学技术，Olson团队报道了NYFa对心肌细胞增殖的调控作用具有空间异质性。在胚胎期小鼠心脏，根据表达谱特征，较为成熟的心室肌细胞可分为3个细胞群(M-VCM1,M-VCM2和M-VCM3)，这些细胞均匀分布于致密心肌或室间隔；而表达谱呈幼稚状态的心室肌细胞亦分为3群，其中F-VCM1广泛分布于心室，F-VCM2分布于心室近小梁区，而F-VCM3则分布于致密心肌或室间隔。此外，空间转录组学技术还鉴定出分布于肌小梁区的细胞亚群T-VCM1和T-VCM2，以及分布于心外膜、表达ECM的心肌细胞亚群CME+，其中F-VCM1-3、CME+的表达谱与单细胞测序中具有再生能力的CM4亚群具有高度重合。在敲除心肌细胞增殖调控因子NFYa的胚胎期小鼠心脏，F-VCM1的比例下降，而小梁区细胞群T-VCM1和T-VCM2的比例升高，提示增殖信号可能通过影响位于不同空间位置的细胞亚群调控心肌增殖[58]。通过这些空间细节，空间转录组学为心肌细胞增殖研究提供了更为全面的视野。
2.2.7其它技术
2.2.8不同工具对心肌再生能力的评估存在差异
表2.不同工具对心肌再生能力的评估存在差异
该表描述了不同检测工具由于其工作原理的不同，对MI是否促进心肌细胞再生得出的结论存在差异。I/R：缺血再灌注；MI：心肌梗死；Sham：假手术组；tdTomato：红色荧光蛋白衍生体；MIMS：多同位素成像质谱。
2.3心肌细胞增殖靶点的干预策略
细胞转染/感染：在NRVMs等原代心肌细胞，脂质体lipofectamine、RNAimax等工具介导的siRNA转染，或体外获得的mRNA转染可实现对特定基因的敲低或过表达，但通过脂质体在NRVMs转染过表达质粒的效率极低。相反，腺病毒(adenovirus,Ad)对NRVMs具有极高的感染和表达效率。
CRIPSR/Cas9:CRISPR/Cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedprotein9)是一种先进的基因编辑工具，在引导RNA(guideRNA,gRNA)的定位下，具有RNA切割功能Cas9可对基因组中的特定序列实现精确的基因敲除、替换或插入。与Cre-loxP/Dre-rox系统相比，CRISPR/Cas9具有编辑效率高的特点，除了用于基因敲除以外，还可以通过不同的Cas变体进行基因激活、抑制、编辑。CRISPR/Cas9系统同样被运用于心肌细胞增殖的研究。利用CRISPR/Cas9技术，研究者在小鼠在体心肌细胞中敲除了非编码RNASnhg1[62]或LDHA[63]，以探究其对心肌细胞增殖的影响。CRISPR/Cas9系统的另一优势是在培养细胞中实现对基因的敲除或多个基因的过表达，例如在人的iPSCs细胞中敲除NOTCH1，以研究其对心肌细胞增殖和分化的影响[64]。在人的成纤维细胞中，过表达失活的Cas9(dCas9)与转录激活因子VP64的融合蛋白(dCas9-VP64)，在不同的gRNA引导下，可同时实现对Gata4、Hand2、Mef2C和Tbx5的过表达，从而将成纤维细胞转分化为诱导多能心脏前体细胞[65]。
CRISPR-CasRx：与CRIPSR/Cas9编辑DNA不同，CRISPR-CasRx系统用于RNA层面的干预。它不需要PAM序列，通过其内含的RNase活性对靶RNA进行切割和降解。通过Myh6-Cre驱动的CasRx在小鼠心肌特异性敲低Meis1和Hoxb13，可促进MI后的心肌细胞增殖与心肌修复。与RNA干扰技术相比，CRISPR-CasRx具有更高的特异性，发生脱靶效应的概率更低[66]。
modRNA:modRNA指在体外转录、获得mRNA，并对mRNA进行一系列化学修饰，以提高其稳定性和翻译效率、降低免疫原性，再将其应用到离体细胞或全身各组织的技术。modRNA具有免疫原性低，瞬时、局部、高效过表达的特性。modRNA主要的化学修饰包括：用尿苷衍生物N1-甲基伪鸟苷(N1-Methylpseudouridine)替代尿苷；在mRNA的5'加入3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G(antireversecapanalog,ARCA)帽子结构，其中3'-O-Me代表核糖3'位上的氧原子(O)被甲基(Me)所取代。ARCA结构能够减少mRNA引起的免疫反应，帮助mRNA被翻译起始复合物所识别，提高mRNA的翻译效率，并抵抗核酸酶从而增加mRNA的稳定性[67]。
通过对modRNA进行进一步改造，可实现心肌细胞特异性过表达特定基因。在Pkm2调控心肌细胞增殖的研究中，研究者设计了两条modRNA(modRNA1和modRNA2),modRNA1的基本结构为5'UTR-L7Ae-cardiacspecificmiRsrecognitionelement-3'UTR。modRNA2基本结构为5'UTR-Kinkturnmotif(K-motif)-Pkm2-3'UTR。modRNA1中编码的古细菌核糖体蛋白L7Ae，可与modRNA2中的K-motif结合，阻碍modRNA2的翻译。当存在心肌特异性miRNAs时，这些miRNAs通过结合到modRNA1的识别元件，将modRNA1降解，从而解除modRNA1对modRNA2的翻译抑制，实现心肌细胞特异性过表达Pkm2。将改造的modRNA在MI造模时注射到小鼠心肌，可在注射后2天检测到Pkm2蛋白水平和活性的增加，并持续到注射后8～12天[33]。通过modRNA在小鼠和猪心肌过表达Pkm2[33]或CCND2[68]，均可促进MI后心肌细胞增殖与心肌修复。
四、心肌再生能力的影响因素
1内外环境因素
运动应激：运动可促进心肌细胞再生，改善MI后心功能。对小鼠进行跑步、游泳等运动训练，可显著提高Ki67阳性的心肌细胞数目[72,73,74]。MIMS发现，小鼠MI后进行跑步运动8周可将心肌细胞增殖能力提高约8倍[48]。心脏环状RNA(circularRNA,circRNA)circUtrn，长链非编码RNA(longnon-codingRNA,lncRNA)CPhar、微小RNA(microRNA,miRNA)miR-222的上调，以及PI3K、EGFR等信号通路的激活与运动促心肌细胞再生作用有关，但运动引起上述改变的作用机制尚不清楚[74,75]。
心室机械张力：心室内机械张力升高被认为是心肌细胞增殖的抑制因素。对于心力衰竭患者，长期使用左心室辅助装置(leftventricularassistdevice,LVAD)可减轻心室压力，诱导成年心肌细胞重新进入细胞周期。与植入LVAD之前的心脏相比，植入LVAD后的心脏中心肌细胞大小减小了45%，线粒体含量减少了60%，而Ki67、PH3、AuroraB阳性的心肌细胞数显著增加，该作用的机制尚不清楚，推测可能与降低氧耗和DNA损伤有关[76]。
甲状腺素等内分泌激素：心肌细胞增殖能力受到内分泌的调控。小鼠出生后不久，血液中的甲状腺激素水平急剧上升超过50倍，这与小鼠代谢、产热水平的增加、心肌细胞退出细胞周期、形成双核以及失去再生能力的变化趋势相一致。使用丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU)阻断甲状腺激素合成，或抑制甲状腺激素受体α(thyroidhormonereceptorα,TRα)功能，均可引起心肌细胞数量增加约3倍[6]。这些数据表明，围产期的甲状腺激素信号在心肌细胞退出细胞周期和多倍体化中发挥重要作用。除甲状腺素外，儿茶酚胺也是调控心脏功能的重要激素，抑制β肾上腺素受体可激活Yap-1/Ect2信号，促进心肌细胞增殖[77]。
在围产期，孕激素水平的急剧减少也与心肌退出细胞周期有关。在胎儿发育期间，孕酮由胎盘和/或卵巢黄体产生供应。新生小鼠离开母体后，血清孕酮水平急剧下降。补充孕酮可通过上调Yap的表达促进小鼠心肌细胞增殖与损伤后修复[78]。
2微环境因素
不同的免疫细胞显示出对心肌再生差异化的调控作用。与P14小鼠相比，P1小鼠心脏在MI后具有更多的巨噬细胞浸润，通过Cl2MDP-L清除P1小鼠巨噬细胞，可抑制心尖切除后心肌再生[83]。反之，移植新生小鼠的巨噬细胞可促进成年小鼠MI后的心肌细胞增殖[84]。巨噬细胞对心肌再生的促进作用依赖于IL-6[83]、oncostatinM[85]等因子的分泌，敲除上述因子可抑制小鼠心尖切除后的心肌再生。
从T细胞数量上来看，MI后P7小鼠心脏较P1小鼠具有更多的T细胞浸润。从T细胞种类上进行区分，P1小鼠心脏以γδ+T细胞浸润为主，而P7小鼠心脏以αβ+T细胞浸润为主，将成年小鼠的αβ+T细胞移植到P1小鼠，可抑制MI后心肌再生，该作用与αβ+T细胞分泌的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)有关[86]。值得注意的是，具有抑炎作用的调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)发挥促心肌增殖的作用。小鼠出生后，Treg在T细胞中所占比例逐渐下降，敲除Treg抑制小鼠心尖切除后心肌再生，Treg的作用依赖于Ccl24、Gas6、Areg等旁分泌因子。这些结果表明炎症/免疫细胞对心肌增殖的调控可能依赖于特定的细胞种类和分泌谱[81]。
淋巴管：胚胎期的淋巴管发育对新生小鼠的心肌再生具有调控作用。在胚胎期第14.5天，心脏淋巴管开始发育，阻碍淋巴管的发育导致心肌增殖减弱，淋巴管内皮细胞分泌的Reln是淋巴管调控小鼠心肌再生的关键介质。然而，在成年MI鼠给与Reln则未观察到明显的促心肌细胞再生作用[87]。
Periostin是发育过程中心脏ECM的重要成分，成年心脏在损伤后可重新表达Periostin。给与成年MI小鼠Periostin可激活位于心肌细胞膜上的整合素-PI3K信号，诱导心肌细胞重返细胞周期，促进心肌再生[90]。在猪MI模型通过心外膜缓释系统持续给与Periostin，可在12个月后将射血分数从31%提高到41%，并将梗死面积缩小约22%[91]。
蛋白聚糖Versican是新生小鼠心脏ECM的另一组分，由心脏成纤维细胞产生。心肌损伤可诱导新生小鼠心脏Versican的上调，并通过整合素β1和ERK1/2、Akt等下游信号分子促进心肌细胞再生。敲除成纤维细胞中的Versican降低新生小鼠的心肌再生能力。在成年小鼠中，向梗死心肌注射Versican可促进心肌细胞增殖，减少纤维化并改善心功能[92]。
ECM对心肌增殖的调控还与其僵硬度(stiffness)有关。P1小鼠与P2小鼠相比，其心肌ECM僵硬度较低，通过化学诱导剂增加P1小鼠心肌ECM的僵硬度，抑制心尖切除后心肌再生[93]。有研究将NRVMs培养在不同僵硬度的ECM上，发现低僵硬度的ECM诱导心肌细胞去分化与增殖，而高僵硬度的ECM则诱导心肌细胞成熟、肌小节组装与心肌细胞收缩[94]。这些结果表明ECM的僵硬度是心肌细胞增殖与成熟的调控因素之一。
心脏神经：在小鼠胚胎期第13.5天(E13.5)，心脏的交感和迷走神经开始分布。通过化学方法、基因工程技术或器械手段损毁心脏的迷走(胆碱能)神经分布，可显著抑制新生个体的心肌再生，该抑制效应可被外源性给与Neuregulin1(Nrg1)或神经生长因子(nervegrowthfactor,Ngf)所挽救，提示心脏胆碱能神经的促心肌增殖作用可能与神经分泌因子有关[95]。
血管新生和侧支循环：损伤后的血管新生/冠脉侧支循环是心脏组织修复过程中的关键因素。斑马鱼心肌损伤后，冠脉向损伤区域发出新生血管是这一过程的早期事件和先决条件：在Vegfa和Vegfc功能缺失的斑马鱼模型，心肌损伤后血管新生和侧支循环受限，心肌细胞不能再生[97,98]。在新生小鼠心脏，受损区域毛细血管的内皮细胞通过Cxcl12-Cxcr4的作用，趋化动脉内皮细胞沿毛细血管迁移并形成侧支动脉循环。Cxcl12或Cxcr4缺陷导致侧支循环受阻，心肌细胞难以再生。在成年心脏，Cxcl12在毛细血管内皮细胞的表达大幅降低，是心肌损伤后侧支循环和心肌再生能力受阻的原因，给与外源性Cxcl12可逆转这一现象[99]。新生血管可能为心肌再生提供了有利的微环境：血管周细胞可通过分泌Angiopoietin-2等因子，调控内皮细胞功能进而调节巨噬细胞浸润[100]，而后者具有促进心肌细胞增殖的作用。进一步阐明血管新生与心肌细胞增殖的关系，以刺激血管新生对提高心肌细胞再生效率的作用，尚需更多研究。
成纤维细胞：成纤维细胞是心脏微环境中调控心肌细胞增殖与成熟的重要因素。成纤维细胞的成熟是成年小鼠心肌细胞增殖能力减退的因素之一。将成年小鼠心脏的成纤维细胞与新生小鼠心肌细胞共培养，可抑制心肌细胞增殖、促进心肌细胞成熟。这一过程受到Cxcl12/Cxcr4以及信号的调控，对其进行干预促进损伤后小鼠心肌再生[101]。另一方面，心肌细胞也可与成纤维细胞对话，调控损伤后心脏纤维化与瘢痕重塑：心肌细胞内的Yap信号可诱导Wnt配体分泌并作用于成纤维细胞，通过非经典Wnt通路抑制成纤维细胞激活，从而抑制胶原沉积与纤维化[102]。
3心肌细胞状态
年龄和老化：谱系示踪技术发现，小鼠的心肌增殖活动在出生后逐渐下降，并在青春期以前(P12)降至成年水平[53]。对不同年龄的人心肌组织进行消化分离，再进行流式细胞分析发现，从出生后1天到出生后第3月、第14月，PH3阳性的心肌细胞数经历两次下降后维持在成年水平[103]。