应用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除小窝蛋白1基因的神经细胞构建与功能鉴定

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞由本实验室保存。JEV病毒株SA14由俞永新教授惠赠。PX459质粒购自美国Addgene公司；Trans1T1感受态购自全式金公司；限制性内切酶BbsⅠ、T4DNA连接酶和T4多聚核苷酸激酶购自美国NEB公司；质粒提取试剂盒购自德国Qiagen公司；Lipofectamine3000转染试剂及羊抗兔AlexaFluor488荧光二抗购自美国Invitrogen公司；二盐酸嘌呤霉素购自美国Selleck公司；鼠抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Proteintech公司；兔抗人CAV-1单克隆抗体购自美国Sigma公司；兔抗JEVNS3抗体购自美国GeneTex公司；DAPI购自瑞士Roche公司；DMEM培养基、细胞培养用青链霉素及胎牛血清为美国Gibco公司产品；质粒测序及寡核苷酸链合成由捷瑞生物公司完成。

取等量的正、反向引物，使其退火形成双链。反应体系：各取100nmol正、反向引物sgRNA，1μl10×T4LigationBuffer，0.5μlT4多聚核苷酸激酶加水至10μl。反应程序：37℃30min；95℃5min；每分钟下降5℃，降至25℃。

使用BbsⅠ线性化PX459质粒，切胶回收。反应体系为：1μgPX459载体，1μlBbsⅠ，5μl10×NEBuffer，加水至50μl。反应程序：37℃15min。

线性化PX459载体50ng，寡核苷酸双链产物150ng，1μl10×T4DNA连接酶缓冲液，1μlT4DNA连接酶，加水至10μl。程序：25℃60min。将产物转化Trans1-T1感受态，挑取单克隆进行摇菌，使用Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒，进行酶切和测序验证。

使用DMEM培养基（含10%胎牛血清）常规培养SH-SY5Y细胞。转染前12h，将SH-SY5Y细胞接种至24孔板中培养，转染时细胞汇合度达到60%~70%为宜。将构建的PX459-CAV-1重组质粒与PX459载体按照Lipofectamine3000转染说明书转入细胞内，并在5%CO2、37℃培养箱中培养。

将PX459-CAV-1重组质粒转入SH-SY5Y细胞，48h后更换含有2μg/ml嘌呤霉素的DMEM培养基进行筛选。2d后将筛选所得混合克隆取1/3细胞继续培养，余下2/3细胞提取蛋白，免疫印迹检测CAV-1的表达情况，确定效率最佳的重组质粒。利用稀释法对效率最佳的混合克隆进行单克隆筛选，将细胞接种到96孔板中（1个细胞/孔）。待细胞长满，移至24孔板中继续扩大培养，得到CAV-1敲除的SH-SY5Y细胞（SH-SY5Y-CAV-1-KO）。

将野生型SH-SY5Y（SH-SY5Y-WT）和筛选后得到的单克隆稳定株SH-SY5Y-CAV-1-KO分别接种至24孔板中培养。待细胞长满后，用PBS缓冲液洗涤细胞2次，加入100μlRIPA裂解液，置于冰上裂解细胞，抽提细胞总蛋白，利用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，经10%变性SDS-PAGE电泳后，用湿转化法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，使用5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭2h，CAV-1抗体4℃孵育过夜（稀释倍数1:1000），TBST洗涤3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2h（稀释倍数1:1000），TBST再洗涤，ECL化学发光后获得目的条带。

在96孔板内接种SH-SY5Y-WT和SH-SY5Y-CAV-1-KO，使感染时细胞密度达到70%左右，每孔加入感染复数（multiplicityofinfection，MOI）为1的JEV，37℃感染2h，去除病毒液并加入100μlDMEM培养基，36h后进行免疫荧光检测。

JEV感染36h后，加入甲醇，置于-20℃20min进行固定和透膜。PBS洗涤3次。每孔加入3%BSA封闭1h。将JEVNS3抗体用1%BSA稀释（稀释倍数1:1000），室温孵育2h。加入羊抗兔的AlexaFluor488进行二抗孵育（稀释倍数1:1000），避光孵育1h。最后DAPI（稀释倍数1:10000）进行细胞核染色，通过荧光显微镜随机取视野拍照，计算视野内的细胞个数。结果以感染率=阳性细胞个数/总细胞个数表示。

通过SPSS17.0软件对数据进行分析，数据采用x±s表示，两组间均数比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。