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一、基因敲除细胞系的构建
1.基因敲除的sgRNA如何设计？
在CRISPR-Cas9系统中，sgRNA（smallguideRNA，sgRNA）通过碱基互补配对原则引导Cas9蛋白酶至基因组特定的靶序列上，Cas9蛋白与PAM序列结合后便可对靶位点进行切割，形成DNA双链切口。sgRNA设计的合理与否，对于CRISPR-Cas9编辑系统的切割效率，甚至最后能否得到KO细胞具有重要影响。目前虽然有诸多高效快速的gRNA设计工具，但我们仍需了解基本的设计原则才能更好地做出判断。sgRNA的设计需要遵循以下原则：
(1)不影响其他基因，尤其是编码蛋白的基因。挑选靶区域时应避免选择与其他基因重叠的区域，且能影响蛋白的功能结构域。
(2)尽可能影响所有的转录本，敲除位点最好在编码区的前50%，但避免敲除ATG所在外显子或ATG之前的外显子。
(3)片段敲除的sgRNA设计在内含子上，这样能敲除整个外显子区，避免翻译出残留蛋白。敲除区域前后序列尽量简单，方便后续的PCR鉴定。同时敲除的外显子编码序列之和为非3的倍数，使靶区域后面的序列发生移码。另外，片段敲除所选定的敲除区域不要超过10Kb，超过10Kb后编辑敲除效率会降低。
(4)在设计sgRNA时要综合考虑候选编辑位点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点等信息。例如靶点的GC%尽量不要低于40%，靶点序列GC%偏高（50%~70%）有较高的打靶效率；靶点内不要有连续4个以上的T碱基，避免形成RNAPolIII的转录终止信号等。
2.如何避免脱靶效应？
研究表明，sgRNA通常会与基因组DNA发生一定概率的序列错配，从而引起非预期的基因组编辑，即所谓的脱靶效应（Off-targeteffects）。为了尽可能避免脱靶效应，可以通过以下几点进行优化：
(1)提高sgRNA特异性。在设计sgRNA序列时，可选择GC含量在50%~70%，与靶基因序列之外的基因组DNA同源性较低的sgRNA序列，同时还可以选择在sgRNA的5’端增加2个鸟嘌呤，来提高sgRNA的特异性。
(2)控制Cas9-sgRNA用量。通过控制Cas9蛋白或sgRNA的表达量来减少脱靶效应，细胞中持续表达Cas9将增加脱靶风险，因此可以通过Cas9蛋白的抑制剂来降低Cas9活性，降低脱靶效应。尽管通过调节sgRNA和Cas9浓度可降低脱靶风险，但浓度降低后，相应的基因组编辑能力也会减弱，要根据实际情况选择合适的gRNA和Cas9复合物比值。
(3)改造Cas9。通过对野生型Cas9进行改造提高CRISPR-Cas9系统的特异性，可将Cas9中的一个酶切位点失活，得到突变型切口酶，由于突变型Cas9只能对单链进行切割，因此需要2条sgRNA同时引导，在DNA不同的链产生2个相近的切口，才能引起双链DNA断裂。只有2条sgRNA均发生错配时才会发生脱靶，这极大降低了脱靶效应。
(4)选择合适的递送载体。目前Cas9可以通过DNA质粒、病毒和蛋白质三种方式传递到靶细胞中，利用Cas9/sgRNA核糖核蛋白（ribonucleoproteins，RNPs）递送系统不会在被编辑的细胞基因组中插入外源DNA序列，可有效减少脱靶效应。
3.如何检测脱靶？
一直以来，CRISPR系统的脱靶效应尚未得到有效的解决，因此对于脱靶效率的检测也有不少研究。
针对细胞外的检测方法有：
(1)Digenome-seqDigestedgenomesequencing，通过Cas9核酸酶体外切割后提基因组DNA，进行高通量测序，鉴定脱位点，生物信息学分析来检测脱靶情况。
(2)CIRCLE-seq，将基因组片段化之后自连接环化，然后用Cas9复合物处理将提取的DNA断裂成300bp后再环化，加入gRNA和Cas9，含有靶标序列的环形DNA会被切割成线性DNA，再对线性的DNA进行高通量测序。
(3)SITE-Seq，在细胞外将DNA在sgRNPs处理后进行高通量测序，该技术使用了sgRNA编程的Cas9对基因组DNA中的剪切位点序列进行识别。
细胞内的检测方法有：
(1)GUIDE-seq，在细胞内通过Cas9切割产生双链断裂后，以非同源性末端接合的方法，引入一段短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas9诱导的脱靶断裂，高通量测序确定脱靶位置。
(2)DISCOVER-Seq，利用DNA修复因子结合染色质免疫共沉淀和高通量测序的方法，可以识别出CRISPR在基因组中切割的的确切位置。
(3)GOTI，利用双细胞胚胎注射RNA和Cas9来评估脱靶效应。用流式细胞技术分选出小鼠胚胎基因编辑细胞和未编辑细胞，全基因组测序进行差异比较分析。
4.CRISPR-Cas9系统的活性检测方法有哪些
通常我们都是采用各个设计网站预测，得到我们的gRNA，那如何能够快速、准确的验证CRISPR-Cas9系统是否能发挥作用呢？
(1)荧光活性检测法。在Cas9和gRNA的作用下，靶点位置的双链DNA会被切割形成DSB，细胞通过同源重组形成有活性的荧光蛋白，可通过流式细胞仪来检测荧光强度是否增强，以此来判断Cas9及gRNA的活性及敲除效率。
(2)错配酶法。对修饰后的靶序列进行PCR扩增过程中，会形成含有错配的DNA双链，将经过错配酶切割后的产物进行凝胶电泳，检测CRISPR-Cas9系统的切割活性。
(3)套峰检测法。对修饰后的靶序列进行PCR并测序，通过分析Spacer区域套峰情况来分析CRISPR-Cas9系统的活性。
5.实现基因lossoffunction，我是要做敲低（RNAi）还是敲除？
(1)当敲除可能会导致细胞增殖非常缓慢或停止生长，或在细胞转染后的cellpool阶段检测效率呈显著下降趋势，即可判定可能出现敲除致死的情况，建议用RNAi。
(2)由于存在部分强功能蛋白，即使表达下调了，仍然有较强的功能，如果RNAi始终做不出表型，但从有关信息推测这个基因很大可能性会出表型，建议做KO；另外，研究的目的基因处于非转录区域，或者目的基因有很强的转录效率，也是无法用RNAi进行有效干扰的，则建议做KO，且KO细胞更适合进行回补实验。
(3)最后，敲低跟敲除不是二选一的关系。当我们用RNAi做了基因敲低，观察到细胞表型的变化后，仍然可以进一步做敲除，让实验结论更加有说服性。
6.实现KO的主要技术手段、技术原理和技术特点是什么？
7.KO的策略有哪些？我们的优势是什么？8.移码突变和片段敲除哪个能更好的破坏目的蛋白的功能结构域？9.如何选择最有效的细胞转染法？10.KO单克隆与KOcellpool的区别？11.构建好敲除细胞系之后，如何进行验证？12.筛选出了很多单克隆杂合子，但无法筛选出纯合子13.是否可以确保蛋白不表达？14.细胞KO的整体流程是？周期大概是多久？15.KO细胞有哪些应用？16.如何实现特定片段的精确敲除？17.除Cas9外，CRISPR技术还有哪些常用核酸酶？有什么区别？18.基因拷贝数对敲除的影响？19.如何确定敲除某个基因会引发细胞死亡或严重影响细胞状态？20.非编码RNA（lncRNA与miRNA）与编码基因的敲除策略有什么差异？21.如何利用CRISPR基因编辑技术做靶基因筛选工作？