dCas9蛋白是Cas9蛋白的突变体，即Cas9内切酶的RuvC1和HNH两个核酸酶活性区域同时发生突变。因此，dCas9蛋白的内切酶活性全部消失，只保留由gRNA引导进入基因组的能力。
CRISPR-dCas9系统提供了一个研究定点转录调控的平台。在这个平台中，dCas9主要是与其他效应蛋白融合（如GFP、转录因子、组蛋白修饰等），进行基因调控，基因组成像，染色质或DNA修饰以及染色质免疫沉淀等。
Figure8:TheCas9nullmutanthaslostbothofitsDNAcleavagedomainswhilestillretainingitsabilitytotargetgenomiclocithroughgRNA:DNAinteractions.ByfusingeffectordomainstotheCas9nullmutant,itispossibletoactivategeneexpression(i.e.V964orNF-kB),repressgeneexpression(i.e.KRBAdomain),visualizegenomicloci(i.e.EGFP),performchromatinremodelling(i.e.TETproteins),andsimplifychromatinimmunopercipitation(throughanantibodyepitopetag)
一、转录调控系统
2013年，齐等人将来自化脓性链球菌的Cas9的核酸酶结构域（在HNH结构域中产生H840A突变和在RuvC结构域中产生D10A突变）进行突变，以产生核酸酶缺陷的“dCas9”。这种“钝化”和“死亡”Cas9失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。
dCas9蛋白可以与效应器（如阻遏蛋白和激活剂结构域）形成融合蛋白，这样，dCas9可以将这些效应器带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤。可用于研究转录因子或辅助转录因子对特定基因的影响。
Figure1：dCas9asamodularsystemforattachmentoftranscriptionalregulators.dCas9caneasilybefusedtoeffectors(eithertranscriptionactivatorsorrepressors)fortargetedgeneregulation.AdaptedfromFigure1aofGilbertetal.(2013).
二、基因激活与抑制系统
1.dCas9系统调节基因的激活或抑制
①.dCas9-SAM—CRISPRCas9基因激活系统
在第一代dCas9-SAM系统中，dCas9与典型的转录激活因子如VP64（单纯性疱疹病毒蛋白16的合成四聚体）或p65（参与许多细胞过程的转录因子）融合。这个系统可以在多种真核细胞的全基因组范围内进行基因激活，但只有中等程度的激活（2-5倍）。
为了增强激活能力，开发了二代dCas9-SAM系统。该系统建立在基本的dCas9-VP64结构上，但其中的sgRNA是经修饰过的，可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这种修饰的sgRNA包含了两段可结合噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构。MS2蛋白与另外的活化剂如p65和人热休克因子1（HSF1）融合，这使得每个dCas9分子可以募集13个活化分子（图2a）。这个新的dCas9-SAM系统可以可靠地将基因表达从10倍增加到几千倍（图2b）。由于这个系统需要设计修饰的sgRNA，人们开发了第三代dCas9-SAM系统，也称为dCas9-VPR系统。这个系统由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，这大大简化了设计过程。当与sgRNA文库结合使用时，该系统还能够支持大规模的全基因组功能激活，使其成为研究生物学过程和途径的有力工具。
dCas9-SAM系统是一种，在不改变内源基因组的条件下，可以选择性地上调特定靶基因表达的简便方法。由于其强大的激活能力，该系统将成为跨越多种细胞类型的治疗性干预、基因筛选工具。研究人员已经开始利用dCas9-SAM系统激活HIV-1转录，诱导细胞凋亡以及诱导休HIV-1前病毒休眠。
Figure2：ThedCas9-SAMtranscriptionalactivationsystem.a)ThedCas9-SAMsystemismadeupofadCas9fusedtothetranscriptionalactivator,VP64.TheaccompanyingsgRNAcanalsobemodifiedtocontaintwoRNAaptamersforbindingwithMS2coatproteinsthatarealsofusedtoonep65andoneHSF1transcriptionactivator.AdaptedfromFigure1fofLaRussaetal.(2015).b)AcomparisonoftheactivationefficiencyofdCas9-VP64byitself(yellow)aswellaswiththemodifiedsgRNAsystem(green)intheactivationoffourdifferentgenes:HBG1,IL-1B,IL1R2,andZFP42.RelativeexpressionlevelswerequantifiedusingqPCR,withfoldchangesdeterminedbycomparingwithGFP-transfectedcells.AdaptedfromFigure1bofKonermannetal.(2015).c)ThedCas9-VPRsystemiscomposedofanorderedfusionoftranscriptionalactivatorsVP64,p16,andRTA.ThissystemdoesnotrequireaspeciallymodifiedsgRNAtoachievethesameactivationcapabilityasthedCas9-SAMsystem.AdaptedfromFigure1aofChavezetal.(2016).d)AcomparisonoftheactivationperformanceofdCas9-VP64,dCas9-VPR,anddCas9-SAMoftheRHOXF2gene.
2.dCas9-KRAB—CRISPRCas9基因抑制系统
单独的dCas9与靶位点的结合在空间上可以干扰转录酶的结合，起到抑制靶向基因转录的作用，这一过程称为CRISPRi（或CRISPR干扰）。这个简单的CRISPRi系统可以高达1000倍抑制，有效敲低细胞中的基因表达。虽然这个系统在细菌，酵母和其他原核细胞中的表现相当好，但它在抑制哺乳动物细胞中的基因表达方面效果较差。
因此我们开发了dCas9-KRAB系统，在这个系统中，dCas9与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB（Krüppel-associatedbox）融合（图3a）。这种增强的CRISPRi系统依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子，通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达。该系统，在瞬时转染期间可以高度特异性地使内源性真核基因表达降低60-80％（图3b）。此外，在HeLa细胞中，稳定整合到基因启动子区域的dCas9-KRAB可以使内源性基因产生5-10倍的抑制作用，当靶位点位于转录起始位点下游50-100bp时可产生100倍的抑制效应。dCas9-KRAB对细胞生长没有影响，使其成为无毒的基因沉默方法。
不同于其他经典的基因沉默方法，如RNAi（一种通过降解细胞质中mRNA来敲低基因表达的方法），dCas9-KRAB系统在DNA水平上提供可抑制。这使得高度特异性抑制非编码RNA，miRNA，反义转录物和核定位的RNA成为可能。
Figure3：ThedCas9-KRABtranscriptionalrepressionsystem.a)dCas9canbefusedtoKRAB,atranscriptionalrepressor.AdaptedfromShalemetal.(2015).b)AcomparisonofrelativeCD71expressionlevelsinadCas9(blue)vs.adCas9-KRAB(red)systemtargetedtoCD71usingthreedifferentsgRNAs.RelativeexpressionlevelsweredeterminedfromflowcytometryforCD71proteinexpression.AdaptedfromFigure3cofGilbertetal.(2013).
三、CRISPR-dCas9-表观遗传调控系统
表观遗传调节是往往是通过影响一段染色质的结构起作用，比如将染色质压缩成紧密状态（异染色质），使基因难以转录，或者使染色质打开以促进转录。表观遗传调节包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化等等。
最近，人们将dCas9与表观遗传修饰酶融合在一起，形成dCas9表观遗传编辑系统，该系统成员如表1所示。
Table1-ThedCas9EpigeneticsToolbox
1.dcas9-组蛋白修饰
①.dCas9-p300表观遗传激活系统（组蛋白乙酰化系统）
dCas9-p300是一种简单而独特的工具，可用于研究调控元件和靶基因表达之间的复杂关系。
Figure4：ThedCas9-p300systemforepigeneticactivation.a)dCas9fusedtothecorecatalyticdomainofp300canacetylatetargetsitesinthegenome.AcetylationofthetargetgenesynergizeswiththeactionoftranscriptionfactorsandRNAPolymeraseII,resultingintranscriptionalupregulation.AdaptedfromFigure1bofZentneretal.(2015).b)ComparisonofrelativeexpressionlevelsofIL1RNwhendCas9byitselfvs.dCas9fusedtothep300catalyticcoreistargetedtotheIL1RNpromoter.RelativeexpressionlevelsdeterminedbyqRT-PCR.AdaptedfromFigure1cofHiltonetal.(2015).
②.dCas9-LSD1表观遗传抑制系统（组蛋白去甲基化系统）
dCas9-LSD1是dCas9-p300激活系统的互补基因抑制系统。在该系统中，dCas9与赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合（图5a）。Kearns等人在稳定表达dCas9-LSD1的小鼠胚胎干细胞系中，设计Oct4基因的远端增强子区域的gRNA，Oct4基因被抑制。然而，当dCas9-LSD1针对Oct4启动子时，没有观察到效果。这使得dCas9-LSD1成为研究增强子调控活性的工具。这与其他系统如dCas9-KRAB（它们是更全面的基因表达控制器）互补。当靶向上游增强子时，dCas9-LSD1也能够使下游基因表达沉默（图5b），而不破坏基因组结构。
Figure5：ThedCas9-LSD1systemforepigeneticrepression.a)dCas9fusedtoLSD1candemethylatetargetsitesinthegenome.Demethylationofthetargetgeneresultsintranscriptionaldownregulation.AdaptedfromFigure1bofZentneretal.(2015).b)TherelativeexpressionleveloftheTBX3genewasassessedviaquantitativePCRanalysiswhenthesgRNAofthedCas9-LSD1systemwasfusedwithadistalenhancervs.apromoter.sgRNAsspecifictoanunrelatedgenomicregionwereusedascontrols.AdaptedfromFigure1eofKearnsetal.(2015).
2.dCas9-DNA甲基化修饰
①.dCas9-Tet1-CD–dCas9-DNA去甲基化修饰系统
dCas9-Tet1-CD是以这种方式编辑表观基因组的新技术之一。该系统由与Tet1（十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶1）的催化结构域（CD）融合dCas9组成，该酶触发DNA去甲基化（图6a）。伴随的sgRNA也可以进行修饰，使之包含一个MS2二聚体，每个二聚体再与两个Tet1-CD模块融合。有研究表明，该系统转染后4天后观察到基因的激活（图6b）。在不同的人和小鼠细胞系中，结合精确的sgRNA设计和控制该系统不同组分的比例，dCas9-Tet1-CD系统及其伴随的MS2-Tet1-CD系统能够在特定位置有效去甲基化，且具有很小的脱靶效应。
Figure6：ThedCas9-TET1-CDsystemfortargetedDNAdemethylation.a)dCas9isfusedtothecatalyticdomainofTET1(TET1-CD).TheaccompanyingsgRNAisadditionallymodifiedtocontaintwoRNAaptamersthatrecruitMS2coatproteins,eachfusedtoaTET1-CD.AdaptedfromFigure1aofXuetal.(2016).b)qRT-PCRwasusedtoassessmRNAlevelsofRANKLgeneexpressionusingtwosgRNAsdesignedtotargettheRANKLpromoterregion(-800bpupstreamoftranscriptionstartsite).AdaptedfromFigure2cofXuetal.(2016).
②.dCas9-DNMT3A—dCas9-DNA甲基化修饰系统
与基于组蛋白的细胞表型控制不同，DNA甲基化对基因表达的作用更稳定和长期。基于dCas9的甲基化系统不仅具有跨物种能力，而且对CpG甲基化不敏感。
dCas9-DNMT3A是先前讨论的dCas9-Tet1-CD系统的甲基化对应物。由Vojta等开发，该系统是dCas9（通过灵活的Gly4Ser接头）与DNMT3A的催化结构域（一种能够在体内甲基化CpG位点的活性DNA甲基转移酶）融合。这个dCas9-DNMT3A系统在HEK293细胞中成功地诱导BACH2启动子上游和下游的位点特异性CpG甲基化，最高浓度的甲基化活性（60％）位于PAM序列下游27bp处。当针对IL6ST启动子时，转染后10天后两种基因的表达水平均显着降低。此外，通过dCas9-DNMT3A与sgRNA池结合同时靶向多个基因特异性位点导致甲基化的协同作用，将甲基化提高2倍，扩大该系统的基因沉默能力。
Figure7:ThedCas9-DNMT3AsystemfortargetedDNAmethylation.a)dCas9isfusedtothecatalyticdomainofDNMT3A.Invivo,DNMT3ArecruitsapartnerfordimerizationalongwithDNMT3Lproteins(shownindashedredboxandovals,respectively).AdaptedfromFigure1aofVojtaetal.(2016).b)RT-qPCRanalysisofIL6STgeneexpressionviadCas9-fusedtoactiveDMNT3A.ExpressionlevelsinducedbydCas9fusedtoinactiveDMNT3AalongwithdCas9accompaniedbynon-targetingsgRNAsweremeasuredasnegativecontrols.Foldchangeisrelativetomock-transfectedcells.AdaptedfromFigure4aofVojtaetal.(2016).