尽管测序和基因组编辑技术取得了重大进展，但是解析复杂的基因型-表型关系仍然是数量遗传学的一个主要障碍。作为强大的基因编辑工具，CRISPR-Cas9系统能够在蛋白编码基因的外显子区域产生移码突变而彻底破坏蛋白表达及功能，这一特性被广泛应用于基因的大规模功能性筛选研究，这也将大大加速评估基因变异的功能影响。
2018年4月Cell期刊上刊登一项研究开发了一种开创性的方法来鉴定和确定在急性髓细胞白血病（AML）中lncRNA在化疗药物产生耐药性中所起的功能作用。这一技术通过结合公开可获得的药理学数据库的信息与CRISPR技术，筛选影响治疗反应的编码基因和非编码基因。作为一种全基因组筛查平台，既不偏向于编码基因，也不偏向于非编码基因，能够筛选到新的治疗靶标[1]。
2.利用一一配对的靶点-模板策略实现全基因组高效精准突变
理解DNA突变体的功能效应对于基础生物学、进化生物学和医学遗传学的研究至关重要；尽管CRISPR-Cas9技术可以实现体内数以千计细胞发生多基因诱导突变的可能，然而高通量测序这些突变体的特异性仍然是技术的瓶颈。2018年4月NatGenet期刊刊登了一篇研究，通过改造CRISPR-Cas9系统，解决了目前高通量测序数以万计基因组编辑结果的这一壁垒，开发了一种基于CRISPR的全基因组高效精确突变工程的方法。如图所示，通过构建10000对编码gRNA靶向序列及其相应的顺式修复模板的质粒文库来实现靶点和模板的一一配对，将文库递送到酵母细胞中监测基因突变的影响，突变效率高达95%。这一策略可以高效精确地追踪大量基因突变对细胞功能的影响，为研究基因的功能提供了强有力的分析工具[2]。
3.Guide+donor：利用CRISPR-Cas9在酵母中高通量构建和功能分析DNA序列变异文库
2018年5月，哈佛基因编辑大牛Church研究组在NatureBiotechnology发文，介绍了一种基于Cas9的方法，在酵母中高效（80-100％）产生特定遗传变异（缺失、替换和插入）的突变体文库，以及整体跟踪其适应性的方法。使用guide+donor方法精确地剔除了酵母基因组中的315个基因，并评估和鉴定了对细胞适应性存活中起重要作用的基因。新的方法不仅能以高通量的方式在酵母菌中精确地进行功能基因组研究，还能深入挖掘低频基因突变及非编码序列的基因功能，为基因功能分析打开了新的大门[3]。
5.MAGESTIC：一种在酵母中可追踪基因组条形码的多重精确基因组编辑技术
6.基于CRISPRi的高通量技术快速绘制人类基因的功能图谱
7.EvolvR：一种结合CRISPR和DNA聚合酶来促进细胞内特定基因进化的平台
2018年8月，加州大学伯克利分校创新基因组学研究所在Nature上发文，提出了一种可以利用自然进化力量的变革性新方法---一个促进细胞内特定基因进化的平台。他们将这个新系统命名为“EvolvR”，这一系统是将Cas9同一种DNA聚合酶融合，利用一种nicking-Cas9只切割两条DNA链中的一条，形成的特殊切口会通过聚合酶补齐。DNA聚合酶补齐的过程会产生错误，导致出现各种不同类型的突变。因此聚合酶这种错误能带来更多的基因多样性，利用EvolvR人为地制造随机突变，创造数百万种不同的序列组合，从中发现许多人为需要的突变物种。这一系统甚至可以实现在一次实验中得到数千种不同的基因多样化，创造出全新的功能，而不仅仅是打开和关闭基因[7]。
8.Pro–Codes：利用蛋白质条形码技术高分辨率分析数百种基因功能的系统
2018年10月，上来自西奈山医院的研究人员在Cell期刊发文，开发了一种在蛋白质水平上的条形码系统(Pro-Codes)，使用线性表位的组合来创建更高倍数的蛋白质条形码，可以同时分析数百种基因功能，分辨率可达单细胞水平。利用合成蛋白“抗原决定簇（epitopes）”标记和追踪不同的CRISPRs，Pro-codes能同时兼容数百个CRISPRs以敲除大量基因，并通过质谱流式细胞技术进行分析。目前利用DNA作为条形码的基因筛选技术仅能实现有限的表型和粗略的细胞分辨率。新型Pro-Codes技术能够以单细胞分辨率同时对100个基因进行高维蛋白质水平的表型分析，可以更全面地描述单个基因的生物学效应[8]。
9.通过CRISPR-Cas9靶向剪切位点来全基因组筛选功能性LncRNA新策略
10.SLICE：一种利用Cas9蛋白电穿孔进行单向导RNA慢病毒感染的系统
二、DNA标记与细胞谱系示踪
1.三项标志性研究通过利用scRNA-seq提供的细胞类型信息来研究斑马鱼的发育过程，展示CRISPR系统在细胞谱系示踪中的可行性
lSpanjaard等人则报告了一种概念上同前者类似的谱系追踪方法，通过核酸酶激活来编辑普遍存在的序列（LINNAEUS），让人们能够确定细胞类型和细胞谱系。该方法涉及胚胎注射Cas9蛋白和靶向16-32个遍布基因组的红色荧光蛋白（RFP）基因的整合位点的gRNA。使用基因组分散的靶序列的基本原理是避免附近的阵列拷贝之间的删除，这可能会删除它们之间的含大量信息的拷贝。LINNAEUS适用于斑马鱼幼体，以及成体心脏，肝脏，胰腺和大脑。该团队使用基于液滴的微流体进行scRNA-seq，突变的RFP序列从转录组中读出，并被分成一个用于转录组范围分析的文库和一个靶向分析RFP序列的文库。除了实验过程，Spanjaard等人突出了生物信息学的挑战和对定制分析方法的需求，因为物种进化研究得出的标准系统发育算法对细胞谱系重建来说并不是最理想的，主要是由于需要大量（数万）的单细胞比较和谱系条码不能完整的检测出来[13]。
2.“创始小鼠（foundermouse）”为CRISPR系统在哺乳动物细胞中进行细胞谱系示踪创造可能
三、基于CRISPR-Cas系统的疾病诊断技术
快速分子诊断技术在许多领域非常有用，包括公共卫生、环境检测和刑事侦查等。基于CRISPR开发的体外诊断技术入选2018年世界十大科技进展。CRISPR-Cas系统现已被证明可特异性地识别并切割DNA和RNA，这暗示了该系统作为通用核酸识别工具的潜在用途。由于靶序列和CRISPR-Cas系统之间识别的特异性，CRISPR-Cas系统已被用于检测点突变或单核苷酸变体。这项技术能够通过分析病原体的DNA或RNA来检测感染过程中的病原体。下面列举了今年以来CRISPR-Cas系统在分子诊断方面取得的重大突破（如下图所示）。
1.基于Cas13的分子检测系统
2.基于Cas12的分子检测系统
lJenniferA.Doudna团队也通过将Cas12a(CpfI)与分子信号枪相结合实现了灵敏而又准确的DNA检测。这种方法被称作DETECTR（DNAEndonucleaseTargetedCRISPRTransReporter）。这一方法的基础在于发现Cas12a在靶向到DNA靶标后具有切割附近所有单链DNA的功能，开发人员利用一种荧光分子通过单链DNA与另一种抑制这一荧光分子发光的抑制分子连接在一起。在Cas12a切割单链DNA后将会移除一直分子，从而让这一荧光分子发光。利用这一技术，他们成功对致癌性HPV病人样品进行了正确的判断[20]。同时我国王金课题组在3月12日的CellResearch杂志上也发表了题为CRISPR-Cas12ahasbothcis-andtrans-cleavageactivitiesonsingle-strandedDNA的研究论文，同前期JenniferDoudna课题组发表的的研究结果类似，系统地研究了Cas12a对于靶标ssDNA和非靶标ssDNA的切割特性[21]。
l此外，上海吐露港的研究团队在2017年基于对侧链单链DNA具有反式切割活性的Cas12a开发的一种高效、灵敏和特异的检测DNA、RNA病毒和人的SNP的平台HOLMES(one-HOurLow-costMultipurposehighlyEfficientSystem)[22]。随后于2018年年底，该团队将同样具有ssDNA反式切割活性的嗜热性Cas12b与LAMP介导的等温扩增(LAMP)相结合，创建了改进版的HOLMESv2。在HOLMESv2中，LAMP扩增和Cas12b反式切割可以整合到一个恒温的一步系统中，因此为核酸检测带来了极大的便利。同时他们还简化了HOLMESv2中的RNA检测程序，使用RNA依赖性DNA聚合酶进行扩增，因此省略了额外的逆转录步骤，这是迄今为止最简单的用于RNA检测的CRISPR生物传感系统[23]。
小结：
综上为大家介绍了CRISPR/Cas9在2018年重大机制进展和诸多方面的应用，可以看到基础科学家已经在利用CRISPR-Cas9技术理解和操纵生物学方面取得了巨大进展，在临床上，我们可以期待基因疾病的新疗法（如利用Cas9基因编辑或CRISPRi/a）和新的诊断技术。我们能够利用大自然的技术工具箱，通过进化改造更多高效且安全的基因编辑工具为我们所用。新的CRISPR系统或许就隐藏在我们周围生物体的基因组中，未来可能会出现更多具有新的机制和功能的CRISPR衍生物，将会为人类提供强大的突破性技术。
参考文献：
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[21]Li,ShiYuan,etal."CRISPR-Cas12ahasbothcis-andtrans-cleavageactivitiesonsingle-strandedDNA."CellResearch(2018).
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[23]L.Li,S.Li,J.Wang,CRISPR-Cas12b-assistednucleicaciddetectionplatform.bioRxiv,(2018).