在医学微生物实验教学中，始终有少数学生忘记穿实验服，或者将手机、书包、笔等随身物品随意丢在实验台上，甚至裸手拿培养皿或者菌种管。完成实验后将棉签、培养基、试纸等接触菌液的物品直接扔到垃圾桶里，这些不良习惯有一定的风险。因为微生物实验经常使用病原性的细菌、病毒，虽然微生物实验教学一般选用葡萄球菌、大肠杆菌等生物威胁较低的微生物进行实验，但是如果学生缺乏微生物安全意识，不规范操作，有可能带来一些不良后果。
二、医学微生物实验教学思考10:09:59
（一）规范操作，加强操作细节及注意事项
（二）利用多媒体技术，改进教学模式
（三）加强实验结果的观察及总结
［关键词］PCR-DGGE;中草药药理；中草药栽培；环境微生物
DGGE技术在土壤［2］、水体［3］、发酵食品等［4］环境的微生物多样性和微生物群落变化等方面的应用，多与其他分子生物学技术（如PCR技术）手段相结合，产生了PCR-DGGE等技术。PCR-DGGE在微生物群落结构研究中，日渐发挥着巨大作用。该技术可以对中草药生长的不同时期或不同的土壤环境中的微生物群落结构组成进行检测，其操作简单，并可同时测定多个样品。假如使用该技术来作为中草药栽培以及药理学研究的辅助手段，可以使研究更加深入、透彻。本文通过研究查阅国内外大量文献资料以及结合笔者等PCR-DGGE应用技术积累的经验，针对于药材土壤环境中的微生物群落应用DGGE分析的主要步骤、常见问题试做简单介绍，以提供参考。
1样品处理
DNA的产率高低直接决定DGGE条带的代表性。产率低，其条带的代表性就差。而环境样品处理的好坏，决定了DNA产率的高低。我们对于土壤样品，一般采取修改后的Bead-Beating法［5］。称取10g土样，放入盛有数粒无菌玻璃珠（直径3～5mm）的三角瓶中，加15ml提取缓冲液。在180rpm，37℃条件下振荡30min，加2ml20%SDS继续振荡10min。65℃水浴1h后6000g离心15min，收集上清液，加0.5倍体积PEG(30%)-NaCl(1.6mol/L)，混匀后室温下静止2h，在10000g离心20min，沉淀用2mlTE重新悬浮。加4mol/LNaCl至终浓度0.3mol/L，用酚-氯仿-异戊醇抽提1次，0.6倍体积异丙醇沉淀2h，12000g离心20min，沉淀干燥后，200μLTE溶解，经纯化后，-20℃保存。
2PCR扩增
在PCR扩增中，引物的选择、扩增程序和PCR产物的质量都会造成群落结构的分析偏差。因此PCR扩增效率必须保证。
2.1引物的选择为完整提取环境样品中的DNA所以一般采用5’端连接了GC夹结构的通用引物，来扩增环境中微生物的16SrDNA的某一序列，引物分上游引物和下游引物两种，可以根据不同需要自行选择或设计。
2.2扩增程序由于扩增的目的DN段的不同，扩增程序会稍有不同，但一般都是采用梯度PCR经过预变性循环、退火恒温循环、延伸等几个步骤。PCR扩增中要注意，模板DNA的量是有一个适宜范围的，质量浓度应在5ng/μl。PCR反应体系的药品添加一定要在冰盒上进行，而且速度要快。另外，扩增时的程序选择，必须选Lidheat。
2.3扩增后的产物检查可进行琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检查，因EB为致癌物质，所以目前一般选用Goldview染色、成像。
3DGGE
3.1DGGE药品的准备多采用双梯度法进行。即聚丙烯酰胺和变性剂为2个梯度，聚丙烯酰胺一般6～12g/100ml，变性剂梯度可以根据情况调整，一般在15%～60%［尿素为7mol/L、甲酰胺为40%(体积分数)时的变性浓度为100%］的范围内，制备胶还需要10g/100ml过硫酸铵以及TEMED。
3.2DGGE胶的制备在DGGE整个过程中，制胶是非常关键的步骤，其步骤比较繁琐。一般要等待3h胶才能凝固。制胶一般经过以下几个步骤：（1）擦净玻璃板；（2）组装制胶器；（3）进胶；（4）插上梳子；（5）试漏检验；（6）凝胶；（7）清洗用具。
3.3电泳在胶制备好之后，可以进行电泳。
3.4染色及成像多采用银染法。银染后将胶放入凝胶成像仪舱内，将胶放平整，排出多余气泡，照相。
3.5条带分析及回收图像可以采用Quantityone（Bio-rad）分析软件进行分析。所得到的DNA条带可以切割下来回收并测序然后登陆NCBI（ncbi.nlm.nih.gov/blast），将所得序列与数据库中已知序列进行比较。用ClustalX和DNAStar进行相似性分析。便可以得知样品中生物的种类，组成比例，微生物的基因序列有何变化等。
3.6结合其他生长条件指标进行该种草药药理特性产生的分析当微生物因素的影响情况得知后，再配合土壤化学成分、温度、湿度、光照等因素的分析情况，即可进行草药生长特性及药理学特性的综合分析。
4PCR-DGGE在中草药药理研究中的应用前景
［参考文献］
1FischerSG，LermanLS.LengthindependentseparationofDNArestrictionfragmentsintwo-ditmentionalgelelectrophoresis.Cell，1979，16:191-200.
2PedroMS，HarutaS，HazakaM，etal.Denaturinggradientgelelectrophoresisanalysesofmicrobialcommunityfromfield-scalecompost.BiosciBioeng，2001，91:159-165.
3ArayaR，TaniK，TakagiT，etal.BacterialactivityandcommunitycompositioninstreamwaterandbiofilmfromanurbanriverdeterminedbyfluorescentinsituhybridizationandDGGEanalysis.FEMSMicrobiolEcology，2003，43:111-119.
4RandazzoCL，TorrianiS，AkkermansADL，etal.Diversity，dynamics，andactivityofbacterialcommunitiesduringproductionofanartisanalsiciliancheeseasevaluatedby16SrRNAanalysis.ApplEnvironMicrobiol，2000，68:1882-1892.
5YeatesC，GillingMR.MethodsformicrobialDNAextractionfromsoilforPCRapplication.BiologicalProceduresOnline.1998，1:40-47.
【关键词】标本；微生物检验；阳性率
1临床资料
1.2方法微生物的检验使用法国梅里埃公司生产的全自动细菌鉴定药敏分析仪进行操作，参照使用指南，严格按照标准化进行操作，保证过程的质量安全。
1.3统计学方法通过SPSS13.0统计软件进行数据检验，以P
2结果
3讨论
3.1微生物标本采集不规范在微生物标本采集上步骤上，不规范主要存在于检验的申请、病人的准备、标本的采集、标本的运输等步骤。文献报道，在各种导致临床微生物检验结果出现偏差的因素中，70%来自微生物标本采集的不规范。由于微生物标本采集的步骤繁琐，主观因素多，所以容易出现问题。而且各医疗单位对于微生物采集的程序标准不同，质量控制标准不同，临床检验人员的技术水平不同，很容易导致微生物标本出现问题，从而导致检验结果的错误。这不仅不能正常的检测出微生物，而且也影响了临床医生的下一步治疗[3]。
3.2微生物标本的运输流程不规范微生物标本的运输对于微生物的活力有一定的影响，主要是影响微生物的繁殖和生长速度，因此运输过程一定要严格按照标准化过程。对于不同类型的微生物，应该按照不同的标准进行，比如对于厌氧的微生物需要严格控制微生物的运输过程中与空气的接触，防止微生物的过度繁殖等问题的出现，以免对检验结果造成影响[4]。有些运送标本的人员对微生物标本的运输规范不能正确掌握，这样的问题在微生物标本的运输过程中也是普遍存在的。
3.3缺乏临床经验微生物的检验不仅需要理论知识而且需要临床经验，对于微生物的检测而言特点有①不能完全脱离手工；②以定性试验为主；③主观判断机会较多[5]。在操作过程中情况变化多，因此这需要临床经验带来的判断力，对操作者的资历、专业经验、检验能力、操作熟练度要求较高。因此，微生物的检测人员的临床技能水平也是十分重要的。个人的经验水平可直接影响到微生物检验结果的正确性。因此，微生物检验人员应强化自身能力，加强业务水平，严格按照质量标准进行操作[6]。标准作业程序手册应解决质量控制，生化试剂，染料，药敏试验，质量控制，实验室设备，实验室监测记录等问题。人体的正常菌群是一个全面的了解也是非常重要的，检验人员应严格控制正常的内源性寄居菌引起的感染，提高了检测的标本阳性率。此外，在检查中，检查员应完成严格的审核和支付，安全完整，准确，有效，及时报告检验结果。
参考文献
[1]童明庆.我国临床微生物检验中的若干问题[J].中华检验医学杂志，2004，27（2）：65-66.
[2]张红梅.卫生微生物检验的质量管理[J].实用预防医学，2007，14（2）：584-585.
[3]张凤梅.微生物检验的质量控制[J].国际检验医学杂志，2009，30（9）：93l
[4]倪语星，杨莉.临床微生物学在感染控制中的作用[J].中华医学杂志，2006，86（9）：581-583.
[5]王雪文，顾克菊，陶建敏.微生物标本采集中的存在问题及干预对策EJ3.上海护理，2009，9（1）：47-48.
[6]郭文涛.如何做好微生物标本分析前的规范操作[J].实用医技杂志，2009，16（10）：796-797.
关键词：微生物学实验课实验教学教学改革
abstract:thisarticlediscussedthecharacteristicsandimportanceofmicrooganismexperimenteducation.itanalyzedthedefectsofthecurrentteachingmodelandemphasizedthepressuretoreformtheexperimentteachingmodel.theautheradvancedsomeproposalsonthemicro-experimentcoursereformfrombisicoperation,atde,teachingequipment,teachingcontentandexaminesystemalsoprospectedthefuturereformonthemicro-experimentcourse.
keywords:micro-experimentcourse;experimentteaching;teachingreform
1当前微生物实验教学存在的问题、弊端
2关于微生物学实验教学改革的几点建议
关于微生物实验教学改革的理论探讨和实践经验有很多[2,3,4,5],这些理论和实践经验在具体的教学实施中也有了较为显著的效果，根据我们当前的微生物实验教学状况，提出了一下几个方面的改革建议。
2.1重视学生基本实验操作技能训练
能否正确熟练的实施实验操作往往是实验能否成功的关键。微生物学实验研究对象主要是形态微小的细菌、真菌和病毒，它们分布广、繁殖快、生长周期短，在自然界中往往是多种微生物混合生长，彼此之间生长代谢关系极为密切复杂，在对一种微生物做纯培养时容易受到污染，这一特点就决定了无菌操作的重要性。在具体操作中仅仅一个小小的细节问题就能造成实验结果的极大误差，甚至导致错误的结果，因此培养学生正确熟练的基本操作技能极为重要。在实验课上，一方面老师要把实验操作步骤给学生做个完整的演示，并且把每一个动作、操作技巧做详细的分解说明，另一方面，要加大学生的实验操作训练强度，加强对学生实验操作的规范性要求。可以将学生分成小组，让每个学生在小组成员之间轮流进行练习，同学之间相互讨论，不规范或错误的地方大家都能得到及时纠正。
2.2将创造型思维理论应用于实验教学
2.3充分利用先进的教学技术和设备
2.4增加综合性、设计性实验
2.5让学生接触科学研究前沿，提高学生自我挑战意识
2.6制定完善的考核机制，优化成绩评定方法
加强对实验课成绩考评的重视力度，不断完善和创新实验课的考试机制，制定高效科学的考试方法，实验课考试要尽可能准确的反应出学生对实验技能和有关知识掌握的情况。首先，注重对学生平时的实验准备、操作、实验结果和实验报告的创新性的抽查，并计入平时成绩，适当提高平时成绩占总成绩的比例。其次，建立实验考试制度，本学期结束前，按照一定比例对学生的实验进行抽查，现场考察学生的实验操作能力并准确地给出成绩。第三，以卷面考试方式，全面考察学生对有关实验知识理论的掌握情况。
3展望
参考文献：
[1]沈萍主编．微生物学[m]．北京：高等教育出版社，2000.
[2]徐克科侯佳佳．高校实验教学模式改革研究[j].陕西教育,2009,(7).
[3]沙涛，称立忠，张汉波等.改革实验内容和教学方法，提高学生微生物实验技能[j].实验技术与管理，2001,18(6):85-87.
[4]郑毅，李慧珍，何文锦等.微生物学教学中加强素质教育的几个方面[j].微生物学通报,1999,26(5):377-379.
[关键词]执业资格环境工程环境微生物实验创新能力
目前，环境工程行业已有注册环保工程师、环境影响评价工程师等执业资格制度，环境工程专业从业人员取得相应的执业资格已逐步成为就业的重要因素和依据。[1][2]而当前高校中原来的课程设置服务于学术型学士培养，专业课程存在重理论、偏实践等问题，面对科学技术的飞速发展和人才竞争的日趋激烈，原有的教学模式和方法也已经不能满足该执业资格体系下培养高级应用型技术人才的需要。[3]“环境工程微生物学实验”是环境工程行业执业资格体系中一门非常重要的专业理论与实践课程，其教学质量高低直接关系到本专业学生的综合理论知识水平和实践技能。因此，我们拟在多年实验教学实践的基础上，结合环境工程行业现行的执业资格制度，从培养计划和教学大纲入手，对该课程的教学内容、教学方法和考核方式等进行改革探索和实践尝试，以强化对学生工程素质与评判思维能力的培养。
一、国内环境微生物实验教学现状
（一）实验内容彼此孤立，知识难以融会贯通
环境微生物学实验安排往往彼此孤立，各个实验之间没有连贯性，且内容重复较多，学生对所做实验缺乏系统综合的概念。虽然能够掌握各个实验的操作过程和细节，但是由于环境问题的解决需要一系列知识点的串联，而导致理论知识和实际问题出现脱节，所学知识也难以融会贯通，无益于学生充分开发应用微生物技术解决环境问题的思路。[4]
（二）灌输式教学方式为主，验证性实验居多
事实上，国内许多环境工程专业本科生培养计划将环境微生物学实验作为课内实验，存在学分少，内容简单、重复等问题，这就形成传统的实验教学方式，即演示式和灌输式实验教学，即先由教师演示并讲解本次实验的目的、原理、所需材料、操作步骤及注意事项等，然后学生分组按操作步骤进行实验，所做实验基本上都是验证性的。另外，由于实验课时少，大部分教师在实验开始前会将样品、灭菌及实验材料都准备好，这样做既不益于培养学生的动手能力，又会降低实验的完整性，整个过程缺少教师和学生的互动，学生在实验过程中没有进行独立思考，这无疑无益于学生创新能力的培养。[4][5]
（三）教学内容陈旧，跟不上现代微生物技术日新月异的发展速度
在现代微生物技术日益进步、日益发展的今天，很多高校的实验教材却数十年如一日，没有及时更新，甚至有些实验方法和设备已遭淘汰，无法满足学生的求知欲，也无益于拓宽学生的知识面和激发学生的学习兴趣。[6]
（四）缺乏强有力的考核机制
多数高校的实验课都是以撰写报告的形式来确定学生的成绩。由于实验课受课时和师资紧张的影响，缺乏人人动手的机会，因此，学生往往对实验课的积极性不高，通常会出现“一人动手大家看”的现象。最后各个小组成员的实验报告互相抄袭，数据处理和实验结果与讨论也没有经过仔细推敲和独立思考，不利于培养学生科学的严谨作风和独立发现问题及解决问题的能力。[7]
二、培养计划和教学大纲的修订
目前，对复合型强，涉及面广的环境微生物学实验进行重新设计，提升为探究性、综合性实验，并作为独立课程列入培养计划和教学大纲，有依据地规范操作，将成为专业应用实验教学层次水平提升的重要步骤。
为了适应执业资格体系下环境工程专业大学生创新人才培养模式，我们在环境工程专业本科生新的培养计划和教学大纲中增设了环境微生物学独立实验课程，在适量增加总学时数的情况下对内容进一步拓展，重新编制实验讲义，其涵盖微生物学实验教学体系既包括“环境中微生物样品的采集与分离、形态结构观察”等基础实验，又包括“细菌总数的测定、大肠菌群的检测、菌胶团的观察及活性鉴定”等环境微生物鉴定与评价技术，使环境微生物实验内容与理论教学内容相辅相成，结构更加完善、合理。
三、教学内容和方法的改革
（一）建设集“基础验证性实验、综合设计性实验及探究性实验”为一体的教学体系
针对传统微生物学实验内容安排彼此孤立，内容重复的缺点，我们将环境微生物学实验课建设为集“基础验证性实验、综合设计性实验及探究性实验”为一体的实验教学体系。如传统的环境微生物学实验一般开设若干个小实验：光学显微镜的操作及细菌个体形态的观察、微生物染色、培养基的制备和灭菌、细菌纯种分离培养和接种技术，这些小实验大都为内容连贯性不强的操作性实验。新的实验体系包括如“原核微生物和真核微生物类群个体形态观察”，重点培养学生最基本的操作技能；“活性污泥中微生物分离、纯化与培养”综合设计实验是在微生物学实验基础上设置的强化学生实验技能、提高学生自主创新与综合能力的实验；而“河水、生活污水中的生物检测与评价”探究性实验着重体现工科环境微生物学课重基础、重操作、重分析、重总结的主题思想。新的教学体系使学生从感性认识到理性认识，从单项技术到密集技术，从简单应用到复合应用，以至完成工程师初步训练的教育过程。
（二）建立开放性实验室，强化工程素质培养
（三）合理运用多媒体教学手段，了解现代微生物学技术前沿
（四）建立科学的考评制度，注重考查学生的主动性、创新性和评判思维能力
我们将更注重考察学生的主动性、创新性和评判思维能力。报告内容不仅要求包括基本的理论知识，如实验的目的、实验原理、仪器材料、实验步骤和实验结果（数据和图表形式），还要包括对实验结果的分析讨论，如实验为什么出现这样的结果，过程中可能存在哪些问题，有没有改善实验的方法，对这些问题进行分析解释有助于加强学生对某些枯燥理论的理解及其在实际工程中应用的认识。再者，由于实验课由原来的课内实验修订为独立实验，将成绩由原来的10%纳入该课程的总成绩改为独立计分，实验教学考核体系需要进一步完善。新的考评制度还将增加以下三个方面：1.以实验理论知识和操作要点为内容进行实验预习问答和笔试；2.实验过程中与教师互动的积极性、实验操作的主动性以及与小组成员的合作性作为衡量实验课成绩评定的重要指标；3.鼓励学生到开放性实验室参与设计性实验，并将这部分作为一项考评指标纳入总成绩。
总之，“环境工程微生物学实验”课程的改革必须转变教学观念和教学目标，更新和拓宽教学内容，改革教学方法等，并将几种改革方式有机结合，才能在专业实验教学中收到良好的效果，培养出执业资格体系下工程实践能力强的技术人才。
[注释]
[1]匡颖，张焕祯.职业资格制度与环境工程本科教学改革探讨[J].教育与职业，2010（17）：107-109.
[2]任屹罡，杨艳琴，张宏忠，等.就业导向型的环境工程本科课程体系改革[J].广西轻工业，2011（27）：122-123.
[3]强虹，梁东丽，池勇志.农林院校环境工程专业实践教学的改革[J].中国林业教育，2013（31）：29-31.
[4]蔡苏兰，梁丽莉，徐威.改革实验教学内容与方法提高环境微生物学实验课的魅力[J].中国科教创新导刊，2008（9）：47-47.
[5]郑莉.环境微生物学开放性实验教学的探究与实践[J].中国现代教育装备，2009（3）：97-98.