涨知识克隆专题七：分子克隆应用工具技术文章

克隆技术，又称为“生物放大技术”，目前应用泛的技术为“分子克隆”，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。

大部分的分子克隆方法，诸如传统分子克隆、TA克隆、Gatway克隆、TOPO克隆、无缝克隆等都绕不开目的片段制备、载体制备、连接、转化、筛选等等步骤。其中，设计引物、载体和片段，都需要使用相应的分子克隆工具进行操作和模拟，接下来小翌会以同源重组为例，具体解析一下分子克隆技术中应用到的那些工具，为您的实验提供好方法。

基因组序列查询工具

图1.NCBI基因序列查询

图2.NCBI基因序列下载

目的片段和载体引物设计工具

获得目的片段后，根据同源重组原理，需要在插入片段的上下游引入15-25bp的同源臂，GC含量40-60%，以保证片段与载体充分接触并进行重组。可以通过翌圣“支持中心”的“同源重组引物设计”点击进入，或者直接点击无缝克隆引物设计软件进行设计引物。输入需要的载体序列和目的片段序列，选择合适的酶切位点（不建议选择载体和片段中都含有的酶切位点），生成引物，如图3、4所示。

图3.翌圣设计软件

图4.翌圣引物设计流程

值得注意的是，多个目的片段插入的双酶切位点，实际添加到第一个片段的5’端和最后一个片段的3’端，中间片段不含有设计的酶切位点。通过引物合成公司合成需要的引物序列。接着使用翌圣高保真PCR试剂盒（Cat#10164ES）PCR扩增目的片段与载体。

载体设计模拟软件

当设计完目的片段后，需要对载体和片段进行模拟连接，保证实验的准确性。可以使用Snapgene软件模拟。以pUC19为载体，KIR3DL2基因为插入片段，进行克隆连接模拟。选择“Actions”—“GibsonAssembly”—“InsertFragment”，输入相应的插入片段和载体序列，如下图5所示，即可生成连接后的载体。点击新生成载体的“History”可以模拟载体与片段连接的具体步骤，如图6所示。

图5.Snapgene同源重组模拟流程

图6.Snapgene同源重组模拟图

模拟步骤后，即可使用翌圣新品通用型多片段快速克隆试剂盒（Cat#10923ES）连接目的片段，该试剂盒满足6μL小体系、10ng低浓度载体与片段的连接，菌落数多，克隆阳性率高，客户反馈效果好，如图7所示。

实验信息：载体大小：5369bp；目的片段大小：1589bp。

实验数据：

图7.10923ES在10μL小反应体系下，低浓度载体（30ng）连接单片段，阳性率100%。A：重组转化平板。B：插入片段PCR鉴定电泳图，泳道1-5分别为菌落1，菌落2，阴性对照，阳性对照（基因组作为模版），阳性对照（PCR纯化片段作为模版）。（上海交通大学）