CRISPR流程

GenlociClassicCRISPR-Cas9内部操作流程ProtocolNo.PT140726-1ProtocolNo.PT140726-11,CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下:pGK1.1U6CACCGCAAA455’-5’3’-3’--~20bp2,操作步骤实验前,请您务必做好以下验证实验:A.单细胞生长情况,确保单个细胞可以正常生长形成单克隆,即,低密度的细胞在培养皿中可以形成单克隆。

B.目的基因的表达情况分析,为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失,首先需要PCR扩增靶基因,并对PCR结果进行测序,确保靶基因的完整存在;其次,您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。

1.设计OligoDNA序列首先,您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的,您可以通过以下在线工具设计:●麻省理工学院的CRISPRDesign:/●德国癌症研究中心的E-Crisp:/E-CRISP/designcrispr下面我们选择麻省理工学院的CRISPRDesign工具来做设计举例,以Fut8基因为例,一次只能输入大小为23~250bp的基因片段,最好一次只输入一个外显子,避免Guide序列跨内含子的。

点击“Downloadasgenbank”按钮,出现以下界面:“Fut8”根据左边的score的高低选取合适的Guide序列,以Guide#1序列为例,2条单链oligo的序列如下(红色字体部分是要与BbsI酶切后的载体相互补的部分):Fut8-F:caccGAATGAGCATAATCCAACGCCFut8-R:aaacGGCGTTGGATTATGCTCATTC※注意:oligoDNA设计序列的第一个碱基必须是G,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G,可自行加一个G上去。

另外,需在位点上下游各设计一条引物,用于后续PCR或测序检测阳性克隆,引物能扩增约300bp的DNA片段,上游引物距突变位点约100bp,下游引物距突变位点约200bp。

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成,纯化级别为PAGE。

2.T4DNALigase连接将合成后的2条单链oligoDNA退火形成双链DNA,再与载体连接,pGK1.1linearvector是线性化载体,无需酶切处理,可直接用于T4DNALigase连接反应,pGK1.1载体已经优化过,其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。

ProtocolNo.PT140726-1ProtocolNo.PT140726-1退火反应体系如下:将以上体系瞬时离心后,置于PCR仪中95℃孵育3min,孵育后自然冷却20min。

取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4DNALigase连接反应,反应体系如下:pGK1.1linearvector2μl双链DNA1.75μlT4DNALigase1μl10xT4DNALigaseBuffer1μlddH2O4.25μl10μl※注意:请您根据步骤1自行设计正链Oligo序列和负链Oligo序列,合成后的2条单链oligoDNA退火复性成双链DNA,再进行T4DNALigase连接反应。

连接产物可以直接转化DH5a高效感受态细胞,转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》,pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性,筛选后的阳性克隆,需测序验证序列的正确性。

3.电转染靶细胞(推荐)转染前进行质粒大提,确保质粒浓度≥2μg/μl浓度,再取4~7μg进行电转染靶细胞,推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号:CTX-1500A),贴壁细胞的数量需1x106~3x106,悬浮细胞的数量需3x106~5x106。

另外,您也可以使用转染试剂转染靶细胞。

4.混合克隆pool检测48-72小时后做有限稀释,一般5块板足够,并取电转后细胞的pool1000个细胞以上离心,去上清,PBS洗一遍,细胞沉淀溶于适量的PBS中,煮5min后模板就制备好了,剩余的pool细胞冻存。

PCR检测(以Fut8基因为例):11步骤所制备的模板5ulFut8-seq-F(10mM):1ulFut8-seq-R(10mM):1uldNTPMixture(10mMeach):1ulTaq酶:0.5ul10XTaq酶buffer:5ulMgcl23ulH2O:33.5ulTotal50ul程序:95℃2mincycles1x95℃20SX℃20S72℃30S72℃5mincycles1x95℃变性5minPCR产物使用CruiserTM酶切15-20分钟,酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。

正链Oligo(100μM)0.5μl负链Oligo(100μM)0.5μlddH2O18μlAnnealingBuffer(20x)1μl20μl}cycles35x上图为混合克隆pool酶切检测,由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞,则进行下一步并计算突变率。

5.CruiserTM筛选阳性克隆将剩余的pool的靶细胞有限稀释后,分到96孔板中进行单克隆培养,如果靶细胞是悬浮细胞,推荐使用CellPlaza(Cat.No.:GP08250)培养细胞,待细胞长好后,取1000个左右的细胞,提基因组,推荐使用GenlociTNA抽提试剂盒(Cat.No.:GL10851S)。

然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆,推荐使用GenlociCruiserTM突变检测试剂盒(Cat.Nos.:GCMD025,GCMD100),对CruiserTM筛选后的阳性克隆进行测序分析,并对碱基缺失结果进行比对分析。

在设计Guide序列时,需要特别注意第一个碱基必须是G,如果您选取的Guide序列的第一个碱基不是G,需要自行加上一个G,因为这个G对于起始转录非常重要。

Q-2:转染效率低,怎么办?A-2:因为Cas9蛋白比较大,就导致整个敲除质粒较大(8kb左右),如此大的质粒很容易导致转化效率低下,尤其是使用脂质体等化学试剂转染时,转染效率会比较低些。

所以,我们推荐使用电转的方法进行转染。

Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer,所以不推荐使用;Life的Neon系统不错,但是因为耗材是镀金的,所以非常贵;而Genloci的CTX-1500A电转仪,转化效率高,不需要单独配制buffer,只需使用无血清的培养基就行,而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。

Q-3:单个细胞不生长,怎么办?A-3:对于单细胞不长的细胞进行敲除,首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。

共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞;也可以使用CellPlazaTM(单细胞培养板),可以把细胞的存活率提高三倍以上。

如果以上方法都不行,建议对细胞进行改造,加快其分裂速度,让单细胞可以很容易生长后,再对目的基因进行敲除。

具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-4:在做高通量样本时,如何才能快速筛选得到阳性克隆?A-4:建议使用错配酶进行筛选,可加快筛选的流程。

目前市面上主要有三种错配酶:CruiserTM酶、T7EI和Surveyor酶。

其中,CruiserTM酶和Surveyor酶属于CelI家族,这两种酶的筛选特异性比T7EI高。

在酶切筛选过程中,T7E1的特异性较差,容易出现假阳性的结果,这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度;Surveyor酶较贵,并且货期较长,所以我们推荐CruiserTM酶,它特异性高且价格合理。

ProtocolNo.PT140726-1ProtocolNo.PT140726-1VI.附录附录ApGK1.1linearVector以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱,线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。

Figure3.pGK1.1插入位点图示Figure4.pGK1.1质粒图谱pGK1.1:ProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.VIICruiserTM操作说明1,操作步骤1)基因组DNA的准备提取细胞的基因组DNA,推荐使用Genloci公司专为阳性克隆筛选设计的TNA抽提试剂盒(Cat.No.:GL10851S),只需500个左右的细胞即可提取全基因组DNA,详细实验步骤请参看GenlociTNA抽提试剂盒(Cat.No.:GL10851S)说明书。

2)杂交DNA的准备a)第一轮和第二轮(巢式)PCR引物设计分别设计FirstPrimers和NestedPrimers。

其中FirstPrimers要求具有较高的特异性,其扩增产物推荐为500~1000bp,NestedPrimers推荐扩增产物长度为300~600bp。

FirstPrimers和NestedPrimers引物对应目的序列的位置如下:模板DNA第一轮PCR产物第二轮(巢式)b)第一轮PCR:获得目的片段将已经提取的基因组作为模板,使用FirstPrimers,以高保真DNA聚合酶扩增获得目的片段,要求目的片段明亮(允许少量杂条带,以及少量弥散)。

同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。

推荐扩增循环数35~40cycles,反应体系25μl,100ng≤模板量≤300ng。

PCR完成后,取7~8μl进行电泳检测。

c)第二轮(巢式)PCR:获得杂交DNA根据第一轮PCR电泳检测中目的条带的亮度,用无菌去离子水稀释扩增产物(可参照Marker的亮度估算产物中DNA的浓度,稀释至总核酸浓度为10~20ng/μl,一般需要稀释10~50倍)。

其中野生型模板扩增产物标记为:WTDNA;待检测的突变型模板扩增产物标记为:MTDNA;根据您的检测样本量的大小取合适量的稀释产物作为第二轮PCR的模板。

GNestDNApolymerase置于-20℃保存,且避免操作污染。

在60s内,GNestDNApolymerase可扩增1kb的DNA片段。

PCR反应程序推荐如下:ProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.ProtocolNo.PT140726-1GenlociBiotechnologiesInc.94℃45s94℃10sTm*10s72℃#15-30s72℃45s95℃3min自然冷却40℃以下10min35cycles*Tm值由NestedPrimer决定,一般为55℃左右。

#产物片段长度≤500bp时,建议为72℃,15s;产物片段长度>500bp时,建议为72℃,30s。

扩增结束后,取2μlPCR产物(实验组)用于下一步CruiserTM酶切检测。

酶切体系如下:3.将实验组和对照组置于PCR仪中45℃孵育15~20min。

经CruiserTM核酸酶切割后形成三个明显片段,分试剂盒中PositiveControlDNA为杂交后的DNA片段,别为393bp、134bp、259bp,其中134bp和259bp片段是酶切后片段,而393bp片段为杂交形成的homo-duplexDNA片段,无酶切割位点,因此,片段大小不变。

Figure2阳性对照的电泳结果M:100bp-DNAMarkerCK+:PositiveControlDNA※注意:酶切验证阳性的克隆,若需要进行测序,需以第一轮PCR产物为模板,使用相应的高保真DNA聚合酶、NestedPrimer引物进行扩增,回收片段送测序即可。

该情况常见于cellpool检测中,因cellpool中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低,导致获得DNA片段中杂交DNA含量过少,此时建议设立2-3个重复分别进行PCR检测,只要检测到CruiserTM酶切条带,则可认为敲除成功,存在阳性克隆。

c.CruiserTM核酸酶失活。

使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。

Q-2:电泳结果中酶切条带大小不是预期大小?A-2:出现该情况表明制备的DNA片段中含有其他杂交位点。

首先,应确认制备的DNA片段是否存在其他DNA的污染;其次,根据酶切结果进行判定:若酶切后形成的各条带单一,可能在DNA片段上含有其他杂交位点,需通过DNA测序检测;若形成的酶切条带数量远多于预期,且随机分布含一定弥散,则可能是DNA片段扩增中,DNA聚合酶错配扩增导致,使用高保真DNA聚合酶重新进行扩增可消除影响。

如果PCR反应出现非特异性扩增的条带,也会导致同样情况,建议调整PCR反应条件,以保证只有特异性扩增的PCR产物用于突变检测。

Q-4:CruiserTMEnzyme检测结果是否会出现假阳性?A-4:CruiserTMEnzyme是通过基因工程生产的CelI同源核酸内切酶,具有更好的稳定性、高度的特异性和高效性,它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源DNA双链。

目前为止,尚未有文献报道使用CruiserTMEnzyme或CelI会出现假阳性,或出现其他核酸酶活性。

Q-5:电泳结果中酶切条带大小与预期一致,就一定是纯合子吗?A-5:因为杂交的DNA片段是通过巢式PCR得到的,所以特异性没有任何问题。

在得到与预期一致的酶切条带后,不能100%判断该样本为纯合子,因为杂合子也能得出同样的结果。

因此,需要进行PCR片段的TA克隆和测序验证。

VII.附录附录A阳性对照说明等量野生型和突变型DNA片段混合,经98℃加热、自然冷却后形成的杂交DNA,该DNA链存在两处突变,均为单碱基突变,突变点间距2bp,如下图所示。

经CruiserTM核酸酶切割后形成三个明显片段,分别259bp,其中134bp、259bp为酶切形成的片段,393bp为杂交形成的homo-duplexDNA片段,134bp、为393bp、无酶切割位点,因此,片段大小不变。

阳性对照推荐用量:10μl体系用量200ng。

附录B目的DNA制备说明提取基因组DNA后,在设计FirstPrimers用于第一轮PCR时,要求其具有较高的特异性,其扩增产物推荐为500~1000bp,NestedPrimer推荐扩增产物长度为300~600bp。

在设计NestedPrimer时,应使突变位点位于片段的1/3~2/3处,且反应后获得的片段大小不应小于100bp,以尽可能增强酶切结果的可观察性。

例如:使用第二轮(巢时)PCR扩增获得全长为400bp的DNA片段,通过调整引物位置,使得预计的突变位点位于距5’-端140bp处,则CruiserTM核酸酶酶切后获得片段应为140bp、260bp。

若以1.5%~2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得3条清晰的片段,大小分别为140bp、260bp、400bp。

VIII.参考文献1.YangB,WenX,KodaliNS,OleykowskiCA,MillerCG,Ku-linskiJ,BesackD,YeungJA,KowalskiD,YeungAT.Purification,cloning,andcharacterizationoftheCELInuclease.Bio-chemistry,2000,39:3533~3541.2.PerryJA,WangTL,WelhamTJ,GardnerS,PikeJM,YoshidaS,ParniskeM.ATILLINGreversegeneticstoolandaaccessiblecollectionofmutantsofthelegumeLotusjaponicus.PlantPhysiology,2003,131:866~871.3.McCallumCM,ComaiL,GreeneEA,HenikoffS.TargetingInducedLocalLesionsINGenomes(TILLING)forPlantFunctionalGenomics.PlantPhysiology,2000,123:439~442.4.OleykowskiCA,MullinsCRB,GodwinAKYeungAT.Mutationdetectionusinganovelplantendonuclease.NucleicAcidsResearch,1998,26:4597~4602.5.WienholdsE,EedenFV,KostersM,MuddeJ,PlasterkRHA,CuppenE.Efficienttarget-selectedmutagenesisinZebrafish.GenomeResearch,2003,13:2700~2707.6.TillBJ,BurtnerC,ComaiL,HenikoffS.Mismatchcleavagebysingle-strandspecificnucleases.NucleicAcidsResearch,2004,32:2632~2641.。

THE END
1.利用SNP和小InDel,人工添加5'碱基制造Indel引物,不用CAPS设计统一的primerF,可以同时扩增AB,primerAR仅扩增A,primerBR仅扩增B,由SNP保证差异性,同时在AR或BR的5'端添加一定的碱基,人工造成indel差异。3个引物合成后等量混合以扩增。 目前已试验成功,故推广。 需要注意的点: 1.人工添加的碱基尽可能短,7-15bp左右,避免引物二聚体的同时尽可能以AT为元素,避免后续引物结https://www.bilibili.com/read/cv40066717
2.杂交枫香基因编辑载体其构建方法及其应用2a、根据实验例3构建的载体pylcrispr/cas9-pds序列设计引物,上、下游引物:sp-t1(seq id no,20,gcggtgtcatctatgttactag)和sp-r(seq id no.21:cccgacatagatgcaataacttc)。 [0190] 2b、用记号笔在步骤1)中的含卡那霉素的lb固体培养基上挑选单菌落,做好标记;在超净工作台中,使用灭菌枪头挑出1/2单菌落,加https://www.xjishu.com/zhuanli/27/202210715444.html
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4.CRISPRCas9基因编辑2gRNA设计(下)CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计(上) 前言: 在上一次文章中,我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列,经由简单评估后选择出合适的sgRNA 1. 使用Snapgene anneal oligo 以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例,根据给出的PTEN sgRNA,完善oligo序列,并再Snapgene软件中匹配出来 https://www.jianshu.com/p/0a3ffd23bdff
5.求助crisprcas9引物设计软件动植物小木虫我知道有两个在线设计引物的软件,不知道是不是你要的 http://crispr.mit.edu/ http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html 就算不是,我觉得你说的那个肯定也是在线设计引物的,不防把关键词在Google里 谢谢你的回复,我也知道有在线设计的软件,但选起来相对复杂,我看文献里他那个挺简单方便的,https://muchong.com/html/201511/9576640.html
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11.CRISPR/Cas9载体设计与构建的作用机理CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法2:根据NtDXR 基因序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version4.2:选择合适的靶位点,筛选要求为:①靶位点主要包括20 个碱基,并且这20 个碱基后面是NGG(N 为任意碱基)3 个碱基的PAM 区(Protospacer adjacent motif,PAM);②靶位点尽量选择在基因编码区的前端。依据靶位点设计原则设计引物https://www.chemicalbook.com/NewsInfo_5909.htm
12.如何正确设计引物?pcr引物设计详细步骤7. 引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列**有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 8. 引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 9. 学会使用软件:PP5,Oligo6,DNAstar,Vector NTI,primer3(这个在线设计**用)。 https://www.magigen.com/how-to-design-pcr-primer.html
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16.(1)引物设计:利用在线网站CRISPOR ( CRISPOR (citation) is a program that helps design, evaluate and clone guide sequences for the CRISPR/Cas9 system.CRISPOR Manual Nov 27, 2024: A one day downtime occurred, sorry. The server is catching up today on submitted jobs. SeeFull list of changeshttp://crispor.tefor.net/
17.一种CRISPR/Cas9介导的植物多基因编辑载体的构建方法和应用.pdf[0010](A)根据基因靶位点序列,通过CRISPR?GE网站在线设计靶序列,合成引物,引物以 pGTR(Xie et al.ProcNatlAcadSciUSA,2015,112:3570?3575)为模板扩增出带有不同靶标 序列的tRNA?gRNA单元; [0011]所述根据靶序列合成的引物序列特征如下所示: [0012]gRNA[x]?F(SEQ ID NO.5): [0013] [0014]gRNhttps://m.book118.com/html/2024/0316/5133140110011123.shtm
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19.AprotocolforCRISPR/Cas9basedmulti为了方便CRISPR/Cas9的靶位点设计, 载体构建, 以及突变靶点测序分析, 本实验室还开发了配套的一站式在线软件工具包CRISPR-GE (http://skl.scau.edu.cn/). CRISPR-GE由5个独立和关联的子程序构成, 包括从参考基因组下载任意区段序列的“seqDownload”, 进行靶点设计的“targetDesign”, 对潜在脱靶位点评估的“ofhttps://engine.scichina.com/doi/10.1360/N052018-00069
20.寡核苷酸工具和应用中心ThermoFisherScientific设计 GeneAssist拷贝数分析工作流生成器 设计您自己的Custom和Custom Plus拷贝数分析 打开 测序 最热门 搜索 Ion AmpliSeq NGS panels 浏览用于SNP、CNV、基因融合和插入缺失检测的寡核苷酸引物对的panel 打开 搜索 用于Sanger测序的引物设计工具 搜索我们包含大约650,000个预设计引物对的数据库,以对人类外显子组https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/oligonucleotides-primers-probes-genes/oligos-tools-utilities
21.科学网—Microbiome:华中农大谢卡斌组利用CRISPR系统改进16SrRNA宿主特异性gRNA对Cas-16S-seq至关重要,我们以前期CRISPR-Plant所使用的gRNA设计工具为基础,通过比较植物和细菌的16S rRNA基因序列,设计出了分别靶向水稻线粒体和叶绿体的不同高特异性的mt-gRNAs和cp-gRNAs,并且也建立了一整套的生物信息学流程以供在其他植物物种中参考使用。由于宿主特异性gRNAs的设计是基于已知的16Shttps://wap.sciencenet.cn/home.php?mod=space&uid=3334560&do=blog&id=1237160